鄭英慧 盧啟貴 黃東紅 謝平金

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006 2.深圳市羅湖醫(yī)院集團羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣州 518001

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種代謝性疾病，其特征在于成骨細(xì)胞形成與破骨細(xì)胞吸收之間的不平衡。它是一種隱秘且不可預(yù)測的疾病，直到晚期才出現(xiàn)癥狀，因此被稱為沉默殺手[1-2]。據(jù)估計，全球骨質(zhì)疏松癥的患病人數(shù)超過2億，每年的醫(yī)療費用超過100億美元[3]，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人們健康的疾病。目前，治療骨質(zhì)疏松癥最常用的藥物為雙膦酸鹽、甲狀旁腺素片段、RANK配體抑制劑以及中成藥等。在這些治療方法中，具有抗骨質(zhì)疏松活性但幾乎沒有副作用的天然化合物值得探討[1]。?；撬岽嬖谟诠趋乐?，但其功能尚不完全清楚。早期有研究[4]表明牛磺酸通過ERK1/2激活信號途徑刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化。同時牛磺酸抑制IL-1α、PGE2和脂多糖誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成[5]。最新一項研究[6]表明補充?；撬峥梢灶A(yù)防酒精對去卵巢(OVX)大鼠骨代謝的影響。這些研究表明?；撬峥赡軐S持老年大鼠骨量有積極的作用。然而，牛磺酸對老年大鼠骨量丟失的影響尚未見報道，因此本研究將觀察?；撬釋夏甏笫蠊橇康挠绊懖⒊醪教接懫湎嚓P(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 材料

將10只3月齡體重(290±10)g的雌性Sprague-Dawley(SD)、20只24月齡體重(510±30)g的雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)飼養(yǎng)在溫度(23±2)°C、恒定濕度(45%～50%)、12 h/12 h暗光照循環(huán)的空調(diào)房間中，大鼠可以自由接觸實驗室提供的標(biāo)準(zhǔn)顆粒飲食和水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為三組：對照組：3月齡雌性大鼠(CON組，10只)；模型組：24月齡雌性大鼠(MOD，10只)；牛磺酸組： 24月齡雌性大鼠(NHS，10只)，接受2 g/kg?；撬?購于南京化學(xué)試劑股份有限公司，純度>98%)灌胃治療；對照組和模型組給予同樣劑量的生理鹽水治療，連續(xù)干預(yù)12周后，在最后給藥治療的第二天清晨處死大鼠并收集血液樣品，同時解剖其雙側(cè)股骨進(jìn)行進(jìn)一步檢測。

1.2 方法

1.2.1血清指標(biāo)測定:收集大鼠動脈血并在4 °C下以1 200 r/min離心10 min。血清骨堿性磷酸酶(BALP，U/L)、1型前膠原氨基端肽(P1NP，ng/L)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP-5b，U/L)和β-膠原降解產(chǎn)物(β-CTX，ng/mL)檢測采用南京建成市售試劑盒，按生產(chǎn)廠家說明書進(jìn)行檢測血清水平。

1.2.2組織學(xué)分析:大鼠右側(cè)股骨在切片之前使用10%的EDTA脫鈣4周。待脫水和石蠟包埋后，右股骨組織切成4 μm厚度進(jìn)行蘇木精-伊紅(H&E)染色。使用醫(yī)學(xué)影像分析系統(tǒng)(BI-2000)獲取股骨干骺端骨小梁結(jié)構(gòu)圖像特征。

1.2.3Micro-CT分析:將左側(cè)股骨標(biāo)本通過Micro-CT測量(μCT80，Sanco Medical，Brüttisellen，Switzerland)，并通過相關(guān)分析軟件(μCT80 Evaluation Program v6.51，Sanco Medical，Switzerland)進(jìn)行評估。掃描后，選擇股骨遠(yuǎn)端高于生長板2 mm的松質(zhì)骨作為VOI，該VOI僅限于股骨內(nèi)部區(qū)域，其中通過使用CT分析器軟件繪制自由形式等高線來提取骨小梁。使用標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)勾勒松質(zhì)骨的微觀結(jié)構(gòu)，通過多平面重組獲得三維(3D)圖像，以確定骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV，%)、骨小梁厚度(Tb.Th，μm)、骨小梁數(shù)目(Tb.N，mm-1)、骨小梁間隙(Tb.Sp，μm) 和骨密度(BMD，mg/cm3)。

1.2.4生物力學(xué)檢測：Micro-CT檢測過后，使用Instron 4302系統(tǒng)進(jìn)行三點彎曲實驗評估。將左側(cè)股骨放在材料檢測機支架上，兩個支架之間的距離為1.5 mm，測試區(qū)域定義為股骨的最中央部分。以2 mm/min的速度施加壓縮載荷直至骨折。通過連接的計算機監(jiān)控骨折時的最大載荷(N)和彈性模量(mm2)的數(shù)據(jù)。

1.2.5蛋白印記檢測：生物力學(xué)檢測之后將左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨組織勻漿于RIPA緩沖液中(Beyotime，中國，上海)。采用BCA蛋白分析試劑盒(Beyotime)測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品用12 % SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上。用5 %脫脂牛奶封閉膜，用特異性抗體：抗P62(1∶500，Abcam)、Beclin-1(1∶1 000，Cst)、抗LC3(1∶1 000，Cst)、抗Runx2(1∶1 000，Abcam)和抗BMP2 (1∶1 000，Abcam)孵育4 ℃過夜。以GAPDH作為內(nèi)對照。用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(Beyotime)顯示蛋白質(zhì)條帶，并用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 19.0 進(jìn)行分析，組間比較使用Tukey檢驗，然后用單因素方差分析(ANOVA)分析各組之間的差異。P<0.05表示比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT結(jié)果分析

股骨干骺端骨小梁二維圖像如圖1 A所示。股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖1B～1F所示。MOD組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較CON組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。NHS組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖1 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結(jié)果Fig.1 Micro-CT detection results of femoral metaphysis of three groups of rats注： A：Micro-三維重建結(jié)果；B：BMD；C： BV/TV；D：Tb.Th； E：Tb.Sp；F：Tb.N；與CON組相比，*P<0.05; 與MOD組相比，#P<0.05。

2.2 股骨組織病理學(xué)

股骨干骺端骨小梁HE染色如圖2所示，CON組織顯示股骨干骺端骨小梁致密，骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正常。MOD組組織表現(xiàn)為疏松均勻的骨小梁變薄，導(dǎo)致骨小梁間隙變寬。NHS組骨小梁數(shù)量和連接增加明顯，表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

圖2 三組股骨的組織病理學(xué)Fig.2 Histopathology of femurs of the three groups注：A: CON組;B: MOD組;C: NHS組；蘇木精-伊紅染色(放大倍數(shù)，×10)。

2.3 股骨的生物力學(xué)變化

股骨三點彎曲試驗表明，CON組的最大載荷和彈性模量均高于MOD組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NHS組的最大載荷和彈性模量均高于MOD組(P<0.05)。見圖3。

圖3 右股骨的三點彎曲試驗結(jié)果Fig.3 Three-point bending test results of the right femur of rats注： 與CON組相比，*P<0.05; 與MOD組相比，#P<0.05。

2.4 血清指標(biāo)比較

各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)BALP、TRACP-5b、P1NP和 β-CTX水平如圖4所示。和CON組比較，MOD大鼠血清BALP、P1NP、TRACP-5b和β-CTX水平明顯升高；NHS治療后能顯著降低BALP、P1NP、TRACP-5b和β-CTX的水平，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)水平Fig.4 The bone metabolism index levels in serum of rats in each group注： 與CON組相比，*P<0.05; 與MOD組相比，#P<0.05。

2.5 WB檢測結(jié)果

和CON組比較，MOD組Runx2、BMP2、Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平明顯下調(diào)，而P62表達(dá)水平明顯上調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。和MOD組比較，NHS組Runx2、BMP2、Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平明顯上調(diào)，而P62表達(dá)水平顯著下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 使用WB檢測Runx2、BMP2、P62、Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對表達(dá)Fig.5 Relative expression of Runx2、BMP2、P62、Beclin-1and LC3Ⅱ/LC3-Ⅰusing Western blotting注： 與CON組相比，*P<0.05; 與MOD組相比，#P<0.05。

3 討論

隨著人類壽命的延長，骨質(zhì)疏松癥已成為一個主要的臨床問題，其特征是骨量和強度的喪失，從而導(dǎo)致脆性骨折[2]。OP治療分為兩類，一類是抑制過度骨吸收的抗吸收藥物，另一類是促進(jìn)骨形成的合成代謝藥物[1]。目前OP的治療藥物包括雙膦酸鹽類化合物、地諾單抗和甲狀旁腺素片段(PTH)。然而，觸發(fā)破骨細(xì)胞凋亡的雙膦酸鹽的作用在大約3～5年后達(dá)到了瓶頸。此外，據(jù)報道[7]長期使用雙膦酸鹽與非典型股骨骨折相關(guān)。此外，停止使用會導(dǎo)致骨周轉(zhuǎn)迅速增加，導(dǎo)致骨迅速丟失，并可能增加骨折的發(fā)生[8]。PTH通過激活成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成，通過與PTH/PTHrP1型受體結(jié)合和刺激Wnt信號通路發(fā)揮作用；然而，甲狀旁腺素的治療被限制在2年內(nèi)[9]；此外，甲狀旁腺素的常見不良反應(yīng)包括頭暈、頭痛、惡心和腿部抽筋[9]。因此需要開發(fā)新的具有抗骨質(zhì)疏松癥作用且無副作用的藥物用于防治老年骨質(zhì)疏松癥。

本研究表明12周牛磺酸治療能顯著提高老年大鼠的BMD。與本研究相似，有研究[10]表明在成長中的雄性大鼠中補充?；撬峋哂酗@著的作用，即在生長早期增加股骨的BMC重量。此外，Choi等[11]一項研究報告指出，在生長期雌性大鼠中補充?；撬岷蟮?周，牛磺酸飲食顯著增加了股骨BMD。此外，與對照組相比，在補充精氨酸和牛磺酸的組中，每單位體重的股骨骨礦物含量顯著增加[11]。本研究中三點彎曲試驗表明年齡導(dǎo)致大鼠股骨最大載荷和彈性模量顯著降低，而?；撬嶂委熌茱@著改善股骨的最大載荷和彈性模量。

Micro-CT和組織切片分析進(jìn)一步表明，年齡會導(dǎo)致股骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重的破壞，?；撬嶂委熀竽茱@著改善年齡導(dǎo)致骨量丟失，提示?；撬峥商岣呃夏甏笫蟮墓橇亢蛷姸?。本研究同時檢測血清指標(biāo)BALP、P1NP、TRACP-5b和β-CTX水平改變。P1NP是一種成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物，β-CTX是膠原的產(chǎn)物[12]，BALP是成骨分化早期的重要標(biāo)志物[13]，TRACP-5b是破骨細(xì)胞分化過程中過度表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示老年大鼠血清P1NP、BALP、TRACP-5b和β-CTX水平升高；而?；撬崮芙档湍挲g對骨代謝的影響，顯著降低P1NP、BALP、TRACP-5b和β-CTX水平。本研究結(jié)果與先前的結(jié)果一致，?；撬崮芨纳乒橇苛魇Т笫竽Ｐ椭泄谴x指標(biāo)[15]。

在最近的幾十年中，人們逐漸意識到自噬在干細(xì)胞的自我更新、多能性、發(fā)育、分化和靜止中起著重要作用[16]。 近年來的研究注意到自噬過程與細(xì)胞分化有關(guān)。例如，在胚胎干細(xì)胞中觀察到自噬蛋白的存在，并且自噬蛋白在分化過程中表達(dá)增加；原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的自噬蛋白，在這些細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞后，其水平降低[17]。在本研究中，使用牛磺酸治療可上調(diào)成骨分化、礦化和成骨相關(guān)蛋白RUNX2和BMP2的表達(dá)。除此之外，蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果證實了?；撬嵩黾恿斯墙M織的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。據(jù)報道[18]，自噬缺陷與年齡導(dǎo)致的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化受損有關(guān)。此外，自噬的激活可以部分逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的老化[19]。本研究表明自噬可能參與牛磺酸對老年大鼠介導(dǎo)的保護作用。

總的來說，?；撬峥梢酝ㄟ^自噬的激活保護年齡引起的骨代謝加速，從而改善了老年大鼠的骨量丟失。但是本研究有其不足之處，首先未進(jìn)一步研究?；撬釋ζ乒羌?xì)胞、成骨細(xì)胞的影響，接下來會研究牛磺酸體外表現(xiàn)；其次，本研究僅僅選取一種劑量的牛磺酸來研究藥物作用，是否是最合適的劑量卻不得而知。接下來會進(jìn)一步研究牛磺酸對不同原因誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的影響。