楊超 沈師 趙露 趙恒 許玉林 卓乃強(qiáng)

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨與關(guān)節(jié)外科，四川 瀘州 646000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一種雌激素缺乏所致的代謝性骨病，其特征是骨骼結(jié)構(gòu)和骨骼特性發(fā)生改變，導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低以及骨量減少[1]。骨重建動(dòng)態(tài)平衡中的干擾是骨質(zhì)疏松癥的根本原因。骨重建是一個(gè)生理過(guò)程，其中成骨細(xì)胞形成新的骨骼，而破骨細(xì)胞重新吸收原始的骨基質(zhì)，是維持成人健康骨骼組織的關(guān)鍵過(guò)程，多種因素參與調(diào)節(jié)這一過(guò)程[2]。雙膦酸鹽、雌激素和雷洛昔芬通常用于治療骨質(zhì)疏松癥，其作用是恢復(fù)骨骼形成和吸收之間的平衡。盡管這些藥物可顯著增加骨量，但它們具有一些局限性和副作用，包括血栓栓塞和胃腸道刺激[3]。因此需要尋找新的藥物來(lái)達(dá)到改善骨質(zhì)疏松癥的同時(shí)盡量減小副作用。大黃素(emodin，DHS)是一種中藥，從何首烏等藥材中提取，具有補(bǔ)益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎等功效[4]。研究表明，DHS可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為成骨細(xì)胞。此外，DHS可以抑制MSC分化為脂肪細(xì)胞[4-5]。然而，尚未研究DHS對(duì)雌激素缺乏引起的骨量流失的確切作用和相關(guān)機(jī)制，因此本研究的目的是為了觀察DHS提取物對(duì)去卵巢誘導(dǎo)雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥的影響以及探究可能的機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 藥品和試劑

大黃素購(gòu)于成都格利普生物科技有限公司，純度為98%；骨堿性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP-5b)和β交聯(lián)的I型膠原β-端肽的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(第20170103批)；TransZol Up Plus RNA試劑盒(批號(hào)ER501)夠自南京建誠(chéng)生物工程公司；兔抗β2AR(批號(hào)ab182136)、兔抗RANKL(批號(hào)ab62516)、兔抗OPG(批號(hào)ab73400)和小鼠單克隆β-actin(批號(hào)ab8226)購(gòu)自Abcam，Co.，Ltd.(美國(guó))；山羊抗兔IgG HRP結(jié)合物(批號(hào)CW0 103 s)和山羊抗小鼠IgG HRP結(jié)合物(批號(hào)CW0 102 s)購(gòu)自中國(guó)江蘇康維世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白測(cè)定試劑盒(批次號(hào)P0012S)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(批次號(hào)P0 012 A)購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)。

1.2 研究方案

30只雌性Sprague-Dawley大鼠，(341±22)g，4月齡，證書(shū)號(hào)為SCXK(Jun)2012007，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠圈養(yǎng)在通風(fēng)的籠子中(每籠4只大鼠)，12 h的明/暗周期，(24±2)℃的溫度和(58±4)%相對(duì)濕度下實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，可以自由接觸大鼠顆粒飼料和自來(lái)水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在麻醉下?duì)大鼠進(jìn)行假手術(shù)(Sham)或雙側(cè)卵巢手術(shù)(OVX)，隨后大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham，n=10)、去卵巢組(OVX，n=10)及去卵巢大鼠+大黃素治療組(OVX+DHS，n=10)，其中OVX+DHS組大鼠術(shù)后第3天開(kāi)始每天一次給予大黃素90 mg/kg鼻飼治療；其他組大鼠給予等量生理鹽水治療，12周后處死大鼠，收集血液和雙側(cè)股骨用于進(jìn)一步檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1血清骨形成和吸收的標(biāo)志物檢測(cè)：按照ELISA試劑盒中的說(shuō)明檢測(cè)血清中BALP、β-CTX和TRACP-5b的水平。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(EnSpire，珀金埃爾默儀器有限公司，美國(guó))在吸光度為450 nm處檢測(cè)所有骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物。

1.3.2BMD和Micro-CT 檢測(cè)：右股骨遠(yuǎn)端的BMD(g/cm2)和骨小梁微結(jié)構(gòu)通過(guò)Bruker-Micro CT(SkyScan 1076，Bruker，Co.，Ltd。，德國(guó))進(jìn)行測(cè)量和分析，掃描圖片的分辨率為9 μm，設(shè)備參數(shù)設(shè)置為65 kV和384 mA。選擇生長(zhǎng)板的下方2 mm處為感興趣區(qū)域(ROI)。骨小梁區(qū)域從該位置開(kāi)始約0.77 mm(100個(gè)圖像切片)，再延伸1.54 mm(200個(gè)圖像切片)。使用軟件自動(dòng)計(jì)算以下3D參數(shù)，包括骨密度(BMD，g/cm2)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.3.3組織病理學(xué)改變：左股骨遠(yuǎn)端用含10%的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)脫鈣4周，然后按梯度脫水并包埋在石蠟中。將包埋好的股骨干骺端組織切成4 μm厚的標(biāo)本，隨后進(jìn)行HE染色。使用光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)觀察骨小梁改變情況。

1.3.4免疫印跡：檢測(cè)右股骨遠(yuǎn)端β-2AR、OPG、RANKL水平。用RIPA裂解緩沖液從股骨組織中提取總蛋白。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白質(zhì)和負(fù)載緩沖液的混合物在95 ℃下煮沸用5%和10%SDS-PAGE分離10 μL總蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF，0.45 μm)膜中。使用3%牛血清白蛋白封閉1 h后，分別與兔抗β2AR(1∶1000)、兔抗RANKL(1∶1000)、兔抗OPG(1∶1000)在室溫下封閉，以β-actin(1∶3000)為標(biāo)準(zhǔn)品。然后使用合適二抗處理?；瘜W(xué)發(fā)光HRP底物檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物，并使用LI-COR C-Digit印跡掃描儀進(jìn)行可視化，并使用相關(guān)的Image Studio 5.2軟件進(jìn)行光密度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行兩組之間的比較。經(jīng)方差分析后，Bonferroni檢驗(yàn)確定兩組之間比較是否有顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 骨形成和吸收指標(biāo)改變

治療12周時(shí)，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)血清骨形成指標(biāo)BALP和骨吸收指標(biāo)TRACP-5b和β-CTX水平改變；檢測(cè)結(jié)果顯示OVX組的BALP水平低于Sham組(P<0.05)。 此外，與OVX組相比，DHS組的BALP水平較高(P<0.05)；OVX組TRACP-5b和β-CTX水平明顯高于Sham組(P<0.05)；而DHS組的TRACP-5b和β-CTX水平低于OVX組(P<0.05，圖1)。

圖1 DHS治療對(duì)骨代謝指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of DHS treatment on bone metabolism indexes注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.2 BMD和Micro-CT分析

Micro-CT分析表明，DHS可以顯著預(yù)防OVX引起的骨流失，并顯著改善微結(jié)構(gòu)小梁骨的微結(jié)構(gòu)，如三維重建所示(圖2)。OVX組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。DHS組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖2 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of micro-CT in the femoral metaphysis of rats in the three groups注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.3 組織病理學(xué)分析

HE染色顯示，與Sham組相比，OVX組左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁稀疏，明顯變薄，骨小梁結(jié)構(gòu)不完整，骨小梁排列紊亂，大量空骨陷窩，骨小梁連通性喪失，骨小梁間間隙增寬。DHS治療12周后，左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)較OVX組明顯改善，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，空骨陷窩減少，骨小梁排列整齊(圖3)。

圖3 三組大鼠股骨的組織病理學(xué) A：Sham組，B：OVX組，C：DHS組；HE染色(放大倍數(shù)，×20)Fig.3 Histopathology of femurs in the three groupsA: Sham group, B: OVX group, C: DHS group; HE staining (magnification, × 20).

2.4 股骨中的蛋白質(zhì)表達(dá)

與Sham組相比，OVX組的β2AR蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與OVX組相比，DHS組β2AR蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與Sham組相比，OVX組OPG蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而RANKL蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。此外，與OVX組相比，DHS組OPG蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而RANKL蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，圖4)。

圖4 使用WB檢測(cè)β2AR、OPG和RANKL的相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative expression of β2AR, OPG, and RANK using Western blotting注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的全身性疾病，其特征是骨量流失，骨強(qiáng)度降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞，這是由于骨形成和骨吸收在重塑過(guò)程中出現(xiàn)失去平衡[6]，特別是在絕經(jīng)后婦女中雌激素水平降低進(jìn)一步影響其平衡[7]。雌激素是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑，在沒(méi)有雌激素的情況下，骨吸收高于骨形成，導(dǎo)致較低的骨密度和較高的骨折發(fā)生率。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見(jiàn)的骨質(zhì)疏松癥，與高發(fā)病率和死亡率、生活質(zhì)量下降和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)顯著相關(guān)[8]。因此，合適有效的治療方案顯得非常有必要。

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在調(diào)節(jié)骨骼重塑和維持骨骼形成與再吸收的平衡方面起著主導(dǎo)作用[9]。成骨細(xì)胞合成和分泌的BALP是骨形成的特定標(biāo)志物，而破骨細(xì)胞釋放的TRACP-5b是骨吸收的標(biāo)志物[10]。此外，國(guó)際骨質(zhì)疏松基金會(huì)和國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)已將血清β-CTX推薦作為骨吸收的重要標(biāo)志[11]。本研究結(jié)果顯示DHS在刺激骨形成和抑制骨吸收方面具有雙重治療作用，代表骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度的BMD用于診斷骨質(zhì)疏松癥和評(píng)估骨折風(fēng)險(xiǎn)[12]。但是，更多的研究表明，骨強(qiáng)度與BMD并不全面相關(guān)[13]。最近研究表明，骨小梁微結(jié)構(gòu)可以被認(rèn)為是預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥中骨質(zhì)流失和結(jié)構(gòu)惡化的決定性參數(shù)[13]。BMD以及3D微觀骨骼結(jié)構(gòu)可以將骨骼強(qiáng)度的預(yù)測(cè)能力從70%提高到95%[14]。本研究結(jié)果表明，DHS治療12周對(duì)骨量和骨小梁微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的積極影響。

大腦是周?chē)M織動(dòng)態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)器，而骨量的中央調(diào)節(jié)則代表了一個(gè)新穎且迅速擴(kuò)展的研究領(lǐng)域。交感神經(jīng)、感覺(jué)神經(jīng)和谷氨酰胺能神經(jīng)支配著骨骼的微環(huán)境[15]。在正常的骨骼重塑過(guò)程中，通過(guò)激活交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放的去甲腎上腺素可以抑制骨骼形成并促進(jìn)骨骼吸收[16]。此外，成骨細(xì)胞表達(dá)的β2-腎上腺素能受體(β2AR)可以介導(dǎo)交感神經(jīng)元對(duì)骨細(xì)胞的作用[17]。β2AR調(diào)節(jié)骨量的機(jī)制通過(guò)刺激破骨細(xì)胞增殖，通過(guò)核因子κB配體(RANKL)/骨保護(hù)素(OPG)途徑的受體激活劑起作用[18]。β2AR的刺激通過(guò)上調(diào)靶基因RANKL導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化和骨吸收[17]。RANKL/OPG信號(hào)傳導(dǎo)途徑是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相互作用機(jī)制中最關(guān)鍵的途徑之一。本研究發(fā)現(xiàn)OVX組股骨β2AR和RANKL水平顯著升高，藥物治療后β2AR和RANKL蛋白表達(dá)明顯降低，這表明DHS可以通過(guò)β2AR調(diào)控RANKL/OPG信號(hào)通路，從而影響骨重建。

但是這項(xiàng)研究有幾個(gè)局限性。首先，PMOP是一種復(fù)雜的情況，涉及多種渠道和途徑。本研究?jī)H通過(guò)β2AR介導(dǎo)的RANKL/OPG信號(hào)通路研究了DHS在PMOP治療中的作用和機(jī)制。第二，本研究的結(jié)果基于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。DHS在體外的抗骨質(zhì)疏松作用需要探索和檢驗(yàn)，以充分支持本研究的結(jié)論。第三，本研究表明DHS防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制是通過(guò)β2AR介導(dǎo)的RANKL/OPG信號(hào)通路的調(diào)控而發(fā)生的，然而DHS抗骨質(zhì)疏松的直接有效靶點(diǎn)仍有待探索。

總之，本研究表明DHS可以改善體內(nèi)OVX大鼠的骨骼形態(tài)和骨骼代謝，并糾正骨骼代謝耦合失衡。而DHS對(duì)OVX大鼠模型中骨量保護(hù)作用和可能與β2AR介導(dǎo)RANKL/OPG信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。