邸 錚， 賈伯陽(yáng)， 周 荔， 王 穎， 左 雪, 張 蓉， 鄔國(guó)慶

(北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 102206)

1 引 言

防曬類化妝品屬特殊用途化妝品，其中含有的防曬劑成分是利用光的吸收、反射或散射作用加入的物質(zhì)，用于保護(hù)皮膚免受紫外線傷害[1]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)(以下簡(jiǎn)稱“規(guī)范”)中規(guī)定了27種準(zhǔn)用防曬劑，并提供了15種防曬劑測(cè)定的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)。其中，奧克立林(化學(xué)名稱：2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸異辛酯)屬于UVB(320～290 nm)紫外吸收劑，多用于高SPF(防曬指數(shù))的產(chǎn)品中[2,3]，是經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)的I類防曬劑，也因其具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，且吸收率高、無毒、無致畸作用[4]，成為目前高端化妝品使用頻次較高的一種防曬劑。

對(duì)于化妝品中防曬劑的監(jiān)測(cè)，一直是化妝品監(jiān)督抽驗(yàn)與安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作的重點(diǎn)內(nèi)容。為確保實(shí)驗(yàn)室維持較高的防曬劑檢測(cè)水平，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和糾正在檢驗(yàn)過程中存在的問題，嚴(yán)格控制和提高實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理水平，本實(shí)驗(yàn)室參加了防曬劑中奧克立林的能力驗(yàn)證工作，并通過建立數(shù)學(xué)模型，分析了對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的不確定度來源。測(cè)量不確定度是對(duì)測(cè)量結(jié)果可能誤差的度量，也是定量說明測(cè)量結(jié)果質(zhì)量好壞的一個(gè)參數(shù)[5]。目前，對(duì)于化妝品中防曬劑測(cè)定不確定度的評(píng)定鮮有報(bào)道。

本文依據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定準(zhǔn)則[6～9]，采用規(guī)范方法，對(duì)能力驗(yàn)證樣品中奧克立林含量進(jìn)行測(cè)定，建立了高效液相色譜法測(cè)定化妝品中防曬劑的不確定度評(píng)定方法，通過分析不確定度的來源，尋找影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素，為提高防曬劑的檢測(cè)水平提供了參考依據(jù)。

2 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

2.1 儀 器

e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；XS 205D電子分析天平(瑞士Mettler公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料

10，25，50 mL容量瓶，1，2 mL單標(biāo)線吸量管，5 mL分度吸量管，依據(jù)JJG 196-2006常用玻璃量器[10]檢定規(guī)程檢定為A類；能力驗(yàn)證樣品(性狀：白色乳液，來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，樣品編號(hào)：TC 137-134)；奧克立林對(duì)照品(來源：德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，純度：98.0%)；甲醇、四氫呋喃為色譜純(來源：德國(guó)Merck公司)；高氯酸為分析純(來源：天津政成化學(xué)制品有限公司)，水為超純水。

3 試驗(yàn)方法

3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱(4.6 mm×25 cm；5 μm)；流動(dòng)相為甲醇：四氫呋喃：高氯酸水溶液(0.2 mL高氯酸+300 mL水)梯度洗脫，見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)為311 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。在此條件下奧克立林與甲氧基肉桂酸乙基己酯的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)為66 873。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of HPLC (%)

3.2 對(duì)照品及標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備

精密稱取奧克立林對(duì)照品12 mg置于10 mL容量瓶中，加四氫呋喃溶解并稀釋至刻度，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取5 mL置于50 mL量瓶中，加混合溶液(甲醇+四氫呋喃+水+高氯酸=250+450+300+0.2,單位mL)稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液Std5，再精密量Std5溶液0.5，1.0，2.0，5.0 mL，分別置于 10 mL容量瓶中，加混合溶液稀釋至刻度，得對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液Std1～Std4。

3.3 供試品溶液制備

取供試品攪拌均勻，精密稱取0.25 g置25 mL容量瓶中，混合溶液溶解，渦旋混勻，超聲振提30 min后混合溶液定容至刻度，混勻，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加混合溶液稀釋至刻度。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

3.4 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

3.5 數(shù)學(xué)模型

供試品中奧克立林的含量測(cè)定公式表示為：

(1)

式中：W為供試品中被測(cè)組分的含量(以酸計(jì))，%；C為供試品中被測(cè)組分的濃度，μg/mL；V為供試品溶液定容體積，mL；M為供試品稱樣量，g；0.689 6為奧克立林由酯折算為酸的折算系數(shù)。

4 結(jié)果與分析

4.1 不確定度的來源

從檢測(cè)過程和數(shù)學(xué)模型分析，奧克立林含量的不確定度來源主要有以下幾方面：(1) 對(duì)照品的純度(PR),稱樣量(MR),對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備(VR)和擬合(Ci)；(2) 供試品稱樣量(MS),溶液制備(VS),供試品的重復(fù)測(cè)量(SS);(3) 對(duì)照品的積分峰面積重復(fù)性(R)。高效液相色譜法的不確定度通過對(duì)照品重復(fù)性測(cè)量予以體現(xiàn)。

4.2 不確定度分量的評(píng)定

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及工作曲線對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)

(1) 對(duì)照品純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(PR)

證書上標(biāo)注奧克立林對(duì)照品的純度為98.0%，不確定度為0.5%，則由對(duì)照品引入的不確定度

(2) 對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(MR)

稱量值m=12.03 mg，其稱量不確定度來源有3項(xiàng)：①重復(fù)性；②數(shù)字分辨率，即可讀性；③天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度的分量。

因天平稱量?jī)纱?一次稱樣，一次稱皮重)，故

則對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(MR)=u(MR)/m=
0.129/12.03=0.010 7

(3) 對(duì)照品溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(CV)

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)所用吸量管、容量瓶帶來的不確定度，分為：①u(CV(V))，吸量管、容量瓶校準(zhǔn)不確定度；②u(CV(T))，溫差導(dǎo)致溶液膨脹的不確定度。需用到的玻璃器具見表2。

表2 玻璃儀器列表[11～13]Tab.2 List of glass instruments mL

表3 吸量管和容量瓶引入的不確定度Tab.3 Uncertainty introduced by measuring pipet and measuring flask

根據(jù)表3各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果，求得 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(Ci)

配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，每一濃度測(cè)定2次，以濃度Xi為橫坐標(biāo)，峰面積Yi為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性方程(Yi=a+bXi)，液相色譜校正表擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=7531+19878X，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。對(duì)同一樣品進(jìn)行了6次測(cè)量，濃度平均值C0=12.393 μg/mL。

按式(2)計(jì)算Yi殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按式(3)計(jì)算奧克立林濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相關(guān)量值的計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度Tab.4 Uncertainty introduced by the standard curve fitting

(2)

(3)

(4)

式中：Yij為由儀器測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的峰面積測(cè)定值；Yi為由線性方程得標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的峰面積計(jì)算值；C0為由線性方程計(jì)算得到的樣品濃度平均值, μg·mL-1；P為樣品測(cè)定次數(shù)(P=6)；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的濃度個(gè)數(shù)(n=5)；m為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各點(diǎn)濃度的重復(fù)測(cè)量次數(shù)(m=2)；Xij為標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的濃度測(cè)定值,μg/mL。

則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(Ci)=0.084 2/12.393=0.006 79

(5) 標(biāo)準(zhǔn)溶液及工作曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由urel(PR)、urel(MR)、urel(CV)、urel(Ci)合成，即：

=0.013 9。

4.2.2 供試品制備對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)

(1)供試品稱量引入的不確定度urel(MS)

單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

天平稱量?jī)纱?/p>

供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(MS)=u(MS)/M=0.912/253.6=0.003 60

(2) 供試品定容體積引入的不確定度urel(VS)

供試品用提取溶劑超聲并定容至25 mL容量瓶中，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中。其不確定度來源有3項(xiàng)：1 mL單標(biāo)線刻度管、10 mL、25 mL容量瓶容積帶來的校準(zhǔn)不確度u1(V)和溫差帶來的不確定度u2(V)。參考第4.2.1(3)節(jié)中容量瓶的不確定度評(píng)定方式及玻璃器具列表2，計(jì)算結(jié)果見表5。

表5 定容體積引入的不確定度計(jì)算Tab.5 Uncertainty introduced by constant volume

由供試品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(3) 供試品重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度urel(SS)

urel(SS)=0.003 09/0.843=0.003 67。

(4) 供試品制備引入的不確定度urel(M)

供試品制備引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由urel(MS)、urel(VS)、urel(SS)合成，即：

= 0.006 02。

4.2.3 測(cè)量重復(fù)性對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)Urel(R)

取濃度為11.79 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液重復(fù)測(cè)量5次(n=5)，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Tab.6 Determination result of repeatability test

利用貝塞爾公式計(jì)算求得實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差后，用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

urel(R)=u(R)/A

=871/244 638=0.003 56。

4.3 合成不確定度urel(W)

各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表7所示。

合成不確定度為：

=0.015 6

實(shí)驗(yàn)中測(cè)得奧克立林含量平均值H為0.843%，則

u(W)=urel(W)×H

=0.015 6×0.843%=0.013 2%

4.4 擴(kuò)展不確定度U95及測(cè)定結(jié)果報(bào)告

取擴(kuò)展因子k=2(置信度為95%)，則奧克立林的擴(kuò)展不確定度為

U95=k×u(W)
=2×0.013 2%=0.026%

當(dāng)奧克立林測(cè)定結(jié)果為0.843%時(shí)，則含量的結(jié)果表示為

(0.843±0.026)%；k=2。

5 結(jié) 論

從各不確定度分量分析可知，化妝品中奧克立林的不確定度貢獻(xiàn)主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及工作曲線的擬合，特別是當(dāng)對(duì)照品稱量較小時(shí)，對(duì)不確定度影響較大。在試驗(yàn)過程中可適當(dāng)增加對(duì)照品的取樣量，并做到規(guī)范操作，減小曲線配制過程中產(chǎn)生的不確定度，以保證測(cè)量結(jié)果有更高的準(zhǔn)確度。

化妝品中防曬劑過量添加會(huì)引起光敏性反映，嚴(yán)重的可致癌[14]，但目前對(duì)于化妝品中防曬劑等限用組分的不確定度評(píng)定報(bào)道不多，當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)邊緣值時(shí)，本文提出的不確定度評(píng)定方法有助于評(píng)價(jià)化妝品中限用物質(zhì)的含量范圍，為化妝品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供了參考依據(jù)。