夏萍

（重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

纖毛蟲(chóng)隸屬于原生生物界，是一類形態(tài)多樣、數(shù)量眾多、分布極為廣泛的單細(xì)胞真核生物。經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的演化形成了其獨(dú)特的接合生殖方式、雙態(tài)核型及多樣性的形態(tài)結(jié)構(gòu)，成為細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)等多個(gè)學(xué)科的模型生物[1]。同時(shí)，纖毛蟲(chóng)在微生物食物網(wǎng)中也扮演著重要的角色，在物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)中發(fā)揮了樞紐作用；此外，營(yíng)寄生或棲生的纖毛蟲(chóng)常對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成危害，且某些水體中纖毛蟲(chóng)大量繁殖可能危害水環(huán)境[2]。因此，纖毛蟲(chóng)的相關(guān)研究一直是國(guó)際基礎(chǔ)生物學(xué)研究的焦點(diǎn)。但纖毛蟲(chóng)因個(gè)體微小、多數(shù)類群難以培養(yǎng)和單體難以分離等特點(diǎn)，阻礙了研究者們進(jìn)一步對(duì)其多樣性的充分認(rèn)識(shí)。

當(dāng)前高通量測(cè)序技術(shù)方興未艾，其具有測(cè)序數(shù)據(jù)量大、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸運(yùn)用到環(huán)境纖毛蟲(chóng)多樣性的研究中，包括不同深度的海水、沉積物、土壤和宿主等環(huán)境。本文對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行概述，并綜述了目前高通量測(cè)序技術(shù)在纖毛蟲(chóng)研究中的應(yīng)用，以期促進(jìn)纖毛蟲(chóng)多樣性研究的進(jìn)一步發(fā)展。

1 高通量測(cè)序技術(shù)概述

1977 年，Sanger 測(cè)序誕生并得到廣泛運(yùn)用，隨后由于研究者們對(duì)大規(guī)模測(cè)序需求的逐漸增加，基因測(cè)序技術(shù)得到不斷發(fā)展。2005 年開(kāi)始，基于焦磷酸測(cè)序原理的GS FLX Titanium 測(cè)序平臺(tái)、基于邊合成邊測(cè)序原理的Illμmina 測(cè)序和ABI 公司的SOLiD 測(cè)序等相繼出現(xiàn)，拉開(kāi)了第二代測(cè)序技術(shù)的帷幕，即高通量測(cè)序技術(shù)。相比于傳統(tǒng)測(cè)序，高通量測(cè)序技術(shù)顯著降低了多樣本、大規(guī)模測(cè)序的測(cè)序成本，且可以直接反饋樣本中各OTU（Operational Taxonomic Unit）的豐度，但較短的測(cè)序長(zhǎng)度一直是二代測(cè)序的痛點(diǎn)[3]。此后，單分子實(shí)時(shí)測(cè)序的出現(xiàn)，標(biāo)志著第三代測(cè)序技術(shù)時(shí)代的開(kāi)始。相比于前兩代測(cè)序技術(shù)，測(cè)序速度和序列長(zhǎng)度都有了較大的提升，同時(shí)也避免了PCR 擴(kuò)增所產(chǎn)生的偏差，但有研究顯示其目前存在較高的錯(cuò)誤率。因此，目前二代測(cè)序技術(shù)仍是大規(guī)模測(cè)序的主流。

2 高通量測(cè)序技術(shù)在水域生態(tài)系統(tǒng)纖毛蟲(chóng)研究中的應(yīng)用

地球水資源豐富，其表面2/3 被水所覆蓋，其中包括江河湖泊等淡水資源，也包括大洋和海水等咸水資源。廣闊的水環(huán)境養(yǎng)育了多種多樣的生物，其中纖毛蟲(chóng)是水域生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。目前，對(duì)纖毛蟲(chóng)多樣性的研究主要集中在海洋生態(tài)系統(tǒng)中。研究表明，不同海洋生態(tài)系統(tǒng)中存在較高的真核生物多樣性，而纖毛蟲(chóng)是其中的主要類群[4]。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的介入，極大地提高了人們對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)中纖毛蟲(chóng)多樣性的認(rèn)識(shí)。2016 年，Gimmler 等[5]在真光層水體中篩選得到1 274 個(gè)纖毛蟲(chóng)的OTU，其中存在許多未被描述的纖毛蟲(chóng)物種，多樣性遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)研究及第一代測(cè)序所獲得的纖毛蟲(chóng)物種數(shù)。研究表明，在海水水域和南海南部淺海海域中的浮游纖毛蟲(chóng)中，舞毛亞綱和寡毛亞綱物種豐度占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[6]。臺(tái)灣海峽中，旋毛綱是浮游纖毛蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)類群；纖毛蟲(chóng)多樣性與海水的營(yíng)養(yǎng)程度呈正相關(guān)，營(yíng)養(yǎng)程度越高的海水具有更高的纖毛蟲(chóng)多樣性，淺層海水中纖毛蟲(chóng)多樣性高于深層，淺層海水中纖毛蟲(chóng)的多樣性隨著深度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且不同深度纖毛蟲(chóng)的群落組成存在顯著差異。底棲纖毛蟲(chóng)中前口綱等為優(yōu)勢(shì)類群；在沉積物中，形態(tài)學(xué)研究表明前口綱和裂口綱為優(yōu)勢(shì)類群，但高通量測(cè)序結(jié)果顯示浮游類纖毛蟲(chóng)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，后有研究表明這可能是沉積物中富集了水體中的浮游纖毛蟲(chóng)的DNA，且沉積物中的纖毛蟲(chóng)多樣性高于自然水體[7]，因此沉積物中纖毛蟲(chóng)的物種組成及多樣性分析還有待進(jìn)一步的研究。

3 高通量測(cè)序技術(shù)在土壤生態(tài)系統(tǒng)纖毛蟲(chóng)研究中的應(yīng)用

通過(guò)檢測(cè)土壤中纖毛蟲(chóng)等原生生物的群落變化，可以監(jiān)測(cè)人類土地利用活動(dòng)對(duì)土地的影響，從而促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。纖毛蟲(chóng)也被認(rèn)為是理想的土地利用變化和土壤環(huán)境壓力的生物指標(biāo)。1913 年，Martin 等[8]證明了原生動(dòng)物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中是一個(gè)較為獨(dú)立的結(jié)構(gòu)，隨后，土壤中纖毛蟲(chóng)的研究逐漸受到研究者們的重視，并主要通過(guò)形態(tài)學(xué)特征及分子系統(tǒng)發(fā)育等對(duì)纖毛蟲(chóng)個(gè)體進(jìn)行研究。目前，中歐地區(qū)的土壤類群是基于形態(tài)學(xué)研究中描述最為全面的，有研究者對(duì)中歐某些地區(qū)采樣并進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明能精確匹配的OTUs 較少，且形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分子數(shù)據(jù)庫(kù)存在明顯的差異[9]。國(guó)內(nèi)也逐漸將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于土壤纖毛蟲(chóng)的研究中，有研究通過(guò)研究土壤中纖毛蟲(chóng)的群落變化評(píng)估退耕還林、退牧還草、施加化肥等對(duì)土壤質(zhì)量的影響，從而判斷上述措施的可行性；也有研究對(duì)西藏那曲、西藏拉薩、甘肅慶陽(yáng)、甘肅蘭州等地區(qū)的纖毛蟲(chóng)群落特征進(jìn)行描述，表明土壤中纖毛蟲(chóng)的物種組成、群落構(gòu)成能夠客觀地描述不同生境的特征，顯示了高通量測(cè)序技術(shù)在群落結(jié)構(gòu)變化研究中的優(yōu)勢(shì)。

4 高通量測(cè)序技術(shù)在寄生或共棲生纖毛蟲(chóng)研究中的應(yīng)用

許多生物的消化道棲息著大量微生物，包括原蟲(chóng)、細(xì)菌和真菌等，其中原蟲(chóng)主要是纖毛蟲(chóng)。纖毛蟲(chóng)的群落構(gòu)成受宿主的食物種類、分布地區(qū)和年齡等因素的影響。研究消化道內(nèi)纖毛蟲(chóng)的物種組成變化及其與宿主之間復(fù)雜的關(guān)系也是營(yíng)養(yǎng)學(xué)、病害學(xué)等的研究熱點(diǎn)之一。有部分研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黑山羊瘤胃中的纖毛蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)分析不同的飼糧、飼料添加劑等對(duì)瘤胃內(nèi)纖毛蟲(chóng)群落的影響[10]。此外，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同中性洗滌纖維（NDF）飼糧水平下塔里木馬鹿的瘤胃內(nèi)的原蟲(chóng)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示內(nèi)毛屬和多甲屬是其消化道內(nèi)的主要屬，原蟲(chóng)的活力與數(shù)量會(huì)受到飼糧水平的影響，但對(duì)原蟲(chóng)多樣性無(wú)顯著影響。Kittelmann 等[11]發(fā)現(xiàn)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的原蟲(chóng)與某些厭氧真菌呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。除上述研究以外，國(guó)內(nèi)外還通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)山羊、奶牛、湖羊、綿羊以及駝鹿等動(dòng)物進(jìn)行研究，涉及瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)與其宿主的種屬、飼糧、瘤胃內(nèi)容物的關(guān)系，原蟲(chóng)與腸道菌群的相關(guān)性等，其應(yīng)用極為廣泛。將分子生物學(xué)的技術(shù)手段與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)相結(jié)合，有助于增加對(duì)動(dòng)物整體的認(rèn)識(shí)，為消化道內(nèi)原蟲(chóng)的研究提供新的思路。

5 結(jié)語(yǔ)

高通量測(cè)序技術(shù)在微生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但在纖毛蟲(chóng)等原生動(dòng)物研究中應(yīng)用較少。已有的研究顯出示高通量測(cè)序技術(shù)在纖毛蟲(chóng)的研究中具有巨大的潛力，但目前的研究主要針對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)類群，罕有對(duì)寄生或棲生的纖毛蟲(chóng)和土壤中自由生活的纖毛蟲(chóng)的多樣性進(jìn)行研究，同時(shí)也極少有研究者研究纖毛蟲(chóng)物種組成與其影響因素。因此，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)更多生境類群進(jìn)行研究，將有助于進(jìn)一步增加對(duì)纖毛蟲(chóng)的認(rèn)識(shí)。此外，目前仍存在大量的纖毛蟲(chóng)物種未被描述，形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分子數(shù)據(jù)庫(kù)并不匹配，增加形態(tài)數(shù)據(jù)、深入挖掘已有的高通量測(cè)序所得的短序列信息也可能是纖毛蟲(chóng)研究發(fā)展的一個(gè)方向。