譚祿奇

（重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

2006年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎授予美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的安德魯·菲爾（Andrew Fire）和麻省理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院的克雷格·梅洛（Craig Mello），以表彰他們發(fā)現(xiàn)RNA雙鏈能引發(fā)基因沉默[1]，這使得學(xué)者們關(guān)注到RNA在生物信息上的重要作用，并開始研究RNA分子的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。

目前的黏孢子蟲研究中，主要是利用核糖體RNA（Ribosomal RNA，rRNA）的一級結(jié)構(gòu)結(jié)合形態(tài)學(xué)對物種進(jìn)行鑒定和分類，利用rRNA序列進(jìn)行生物信息比較和推測黏孢子蟲物種和類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。rRNA二級結(jié)構(gòu)已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，但在黏孢子蟲的研究中只有部分學(xué)者應(yīng)用。本文將rRNA二級結(jié)構(gòu)及其在黏孢子蟲中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為以后的黏孢子蟲研究提供參考。

1 rRNA二級結(jié)構(gòu)特征

rRNA二級結(jié)構(gòu)是由其一級結(jié)構(gòu)通過A-U和G-C配對，自身回折形成雙鏈和環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及部分單鏈組合形成的平面結(jié)構(gòu)。rRNA的二級結(jié)構(gòu)比其一級結(jié)構(gòu)（序列）更加保守，不同的同源rRNA序列可能有相同或相似的二級結(jié)構(gòu)，只要原有的堿基互補情況沒有變化，其二級結(jié)構(gòu)就會較為穩(wěn)定。但也有可能在一級結(jié)構(gòu)中少數(shù)的堿基改變導(dǎo)致堿基互補改變，在二級結(jié)構(gòu)中引起本質(zhì)性的差異。

rRNA的功能往往與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。rRNA二級結(jié)構(gòu)是形成rRNA三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，是通過其一級結(jié)構(gòu)了解其三級結(jié)構(gòu)和更高級結(jié)構(gòu)的一個途徑，進(jìn)而了解rRNA結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。通過對RNA結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證明，RNA二級結(jié)構(gòu)中的許多環(huán)狀結(jié)構(gòu)與RNA的功能密切相關(guān)，而rRNA也不例外。

2 rRNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

目前，學(xué)者們已開發(fā)了很多預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)的軟件，常用的有RNAfold、MFOLD、Pfold和RNAStructure等。在黏孢子蟲的研究中，主要利用的是MFOLD和RNAStructure。MFOLD為在Unix平臺操作的軟件，由ZUKER開發(fā)，主要原理是最小自由能方法和動態(tài)規(guī)劃算法[2]。MFOLD軟件不僅可以人為設(shè)定先驗知識、內(nèi)環(huán)的最大不對稱值和堿基對之間的最大距離等參數(shù)，還支持環(huán)形RNA的預(yù)測，且每次提供多個可選擇結(jié)構(gòu)以及圖形輸出，但是只能測定單個序列[3]。RNAstructure為在Windows系統(tǒng)操作的軟件，是DAVID根據(jù)Sankoff算法和動態(tài)規(guī)劃算法開發(fā)的[4]，此軟件功能強大、操作簡單，每次可以提供一個或數(shù)個可供選擇的結(jié)構(gòu)，但此軟件的字母表只能選擇AGCU，無法識別其他字母[3]。

3 rRNA二級結(jié)構(gòu)在黏孢子蟲分子系統(tǒng)學(xué)中的應(yīng)用

以往對于黏孢子蟲的分子研究，主要應(yīng)用的是小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）基因，此基因是地球上所有生命中普遍存在的基因，其長度適中、所含信息量大、容易獲取且進(jìn)化速度比較緩慢。利用SSU rRNA的一級結(jié)構(gòu)可以確定同種生物的遺傳變異和不同種生物的分子差異，利用SSU rRNA的一級結(jié)構(gòu)構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹還可以探討生物物種在進(jìn)化過程中的地位、分歧時間以及親緣關(guān)系等系統(tǒng)發(fā)育問題。雖然基于SSU rRNA基因一級結(jié)構(gòu)為分子標(biāo)記的系統(tǒng)學(xué)研究解決了很多問題，但一級結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)學(xué)研究中仍然具有一定的局限性。

已有研究表明，SSU rRNA基因各結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)信息可以作為系統(tǒng)發(fā)育分析和物種分類的有用標(biāo)記[5]，SSU rRNA基因的二級結(jié)構(gòu)是解決許多生物群體中某些進(jìn)化和分類問題的有力工具。因此，黏孢子蟲研究者也開始利用SSU rRNA基因的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)化和分類問題的研究。

2007年，HOLZER等[6]預(yù) 測 了 鱒 球 孢 蟲（Sphaerospora truttaeFischer-Scherl et al.，1986）和其他28種黏孢子蟲以及鱘卵螅（Polypodium hydriformeUssov，1885）的18S rRNA基因的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析研究了黏體蟲綱的系統(tǒng)進(jìn)化，這是二級結(jié)構(gòu)首次應(yīng)用于黏孢子蟲的研究中。他們發(fā)現(xiàn)，18S rRNA的黏體蟲V4和V7二級結(jié)構(gòu)具有有價值的、復(fù)雜的特征，可以提供重要的額外信息來補充基于這些區(qū)域以外的主要序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育研究。他們研究確定了黏體動物18S rRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)化變化，認(rèn)為為了在系統(tǒng)發(fā)育分析中包含可變區(qū)域，必須保證類群之間的位置核苷酸同源性，且無脊椎動物宿主轉(zhuǎn)換似乎與18S rRNA的結(jié)構(gòu)變化和更高的系統(tǒng)發(fā)育聚類密切相關(guān)。

此后，部分該領(lǐng)域?qū)W者也開始構(gòu)建二級結(jié)構(gòu)，并用于物種的輔助分類和探索物種間的系統(tǒng)發(fā)育與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。2010年，HOLZER等[7]預(yù)測了海式楚克拉蟲（Zschokkella hildaeAuerbach，1910）及其近源種和其他黏孢子蟲的SSU-rDNA的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)寄生于泌尿系統(tǒng)的所有海洋分支黏體蟲在V4區(qū)存在一個共同的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)在同樣寄生于泌尿系統(tǒng)的球孢蟲中也存在，這種結(jié)構(gòu)在這兩個群之間建立了一種聯(lián)系。2018年，楊生華等[8]預(yù)測了口腔碘泡蟲（Myxobolus oralisLiu et al.，2014）、倪李碘泡蟲（Myxobolus nieliiLandsberg & Lom，1991）、住心碘泡蟲（Myxobolus heartiChen，1998）、多涅茨尾孢蟲（Henneguya doneciSchulman，1962）這幾個近源種的18S rRNA V4區(qū)二級結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了比較區(qū)分。2020年，張金葉等[9]預(yù)測了田中碘泡蟲（Myxobolus tanakaiKato et al.，2017）及其近源種的二級結(jié)構(gòu)，選取V2、V4和V7區(qū)分析了它們的變異度。2020年，CHEN等[10]對應(yīng)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建了62種黏孢子蟲SSU-rRNA序列的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)H37、H17、E23_15和H24的結(jié)構(gòu)差異與系統(tǒng)發(fā)育聚類密切相關(guān)。2021年，XIANG等[11]預(yù)測了偽顯著碘泡蟲（Myxobolus pseudonobilisXiang et al.，2021）及其近源種的18S rRNA二級結(jié)構(gòu)，并結(jié)合其他特征確定了偽顯著碘泡蟲為獨立物種。

4 結(jié)論與展望

目前關(guān)于黏孢子蟲的研究，二級結(jié)構(gòu)分析還不普遍。科研者對于rRNA一級結(jié)構(gòu)折疊為二級結(jié)構(gòu)的很多機(jī)制還不是很了解，因此現(xiàn)在開發(fā)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)是否是真實的還未可知，rRNA序列折疊為更高級結(jié)構(gòu)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。但是，rRNA作為良好的分子材料，利用其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)研究對于分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的發(fā)展都有著很重要的意義。