袁 勛，顧澤華，邵 蕾

1.上海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)裝備管理處，上海 200071；2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院編輯部，上海 200065

2020年4月18日，國務(wù)院印發(fā)了《關(guān)于進(jìn)一步做好疫情期間新冠病毒檢測有關(guān)工作的通知》，要求三級醫(yī)院具備獨(dú)立開新冠病毒檢測能力。新型冠狀病毒與SARS 冠狀病毒是同一類，但不是同一種。2020年1月12日被世界衛(wèi)生組織命名為2019-nCoV，2020年2月11日被國際病毒分類委員會命名為SARS-CoV-2。

患者在感染了新型冠狀病毒后最為常見的臨床表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、氣促和呼吸困難等呼吸道癥狀。較為嚴(yán)重的患者可能導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡的情況。

確診病例需有病原學(xué)證據(jù)陽性結(jié)果(實(shí)時熒光RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性；或病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源)［1］。

具備新冠疫情檢測能力就要求醫(yī)院具備二級以上實(shí)驗(yàn)室，具備核酸檢測的能力。

1 核酸檢測原理

1.1 原理

除病毒之外的所有生物均由細(xì)胞所組成，核酸是在細(xì)胞核里面的一類生物聚合物，是所有已知生命均有的生物化學(xué)成分，參與遺傳物質(zhì)保存、繁殖等生化合成和細(xì)胞代謝，決定著細(xì)胞或機(jī)體的性狀表現(xiàn)。

病毒作為最簡單的一種生物，是由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。核酸由核苷酸組成，而核苷酸單體由5-碳糖、磷酸基和含氮堿基組成。如果聚合物中核苷酸的5-碳糖是核糖，則形成的聚合物是核糖核酸(簡稱RNA)；如果5-碳糖是脫氧核糖，則形成的聚合物是核糖核酸(簡稱DNA)。

每一個生物的核酸是不一樣的，通過核酸檢測就是要確定人身上是否帶有病毒，也就是為了檢出病毒的攜帶者。病毒攜帶者如果有癥狀的話就是患者，如果沒有癥狀就是無癥狀感染者。

1.2 核酸檢測操作流程

采樣→樣本包裝→樣本送檢→樣本接收→樣本保存和管理→核酸檢測(樣本前處理→核酸提取和加樣)→結(jié)果判讀與報告→檢測后樣本的處理和保存

1.2.1 采樣要求

鼻咽拭子：拭子貼鼻孔進(jìn)入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入。待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后采集拭子，見圖1。將拭子頭浸入含2～3 mL 病毒保存液(也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液)的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

圖1 鼻咽拭子采集示意圖Fig.1 Schematic diagram of nasopharyngeal swab collection

咽拭子：拭子放入無菌生理鹽水中濕潤(禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏)，將拭子越過舌根，兩側(cè)咽扁桃體、咽后壁上下擦拭至少3 次，見圖2。將拭子頭浸入含2～3 mL 病毒保存液(也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液)的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管中［2］。

圖2 咽拭子采集示意圖Fig.2 Schematic diagram of pharyngeal swab collection

深咳痰液：要求被采集人員深咳后，將咳出的痰液收集于含3 mL 采樣液的50 mL 螺口塑料管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入2～3 mL 采樣液，或加入痰液等體積的痰消化液。

1.2.2 病毒核酸檢測基本要求

實(shí)驗(yàn)室按試劑說明書編寫試劑準(zhǔn)備、病毒滅活、核酸提取、擴(kuò)增檢測、結(jié)果分析及報告等的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并在各個區(qū)域的操作過程中嚴(yán)格遵照執(zhí)行。嚴(yán)禁混樣檢測。

樣本前處理要求

(1)在標(biāo)本制備區(qū)的生物安全柜內(nèi)取出樣本，用75%乙醇消毒樣本容器。

(2)咽拭子和鼻咽拭子建議病毒滅活后再進(jìn)行核酸提取。

(3)病毒滅活要求：56 ℃，滅活時間30～45 min。注意：如使用干預(yù)滅活，需保證樣本管與金屬浴管壁密切接觸。

(4)對痰液應(yīng)充分振蕩混勻后進(jìn)行病毒滅活。

(5)痰液如果有濃痰無法吸樣時，可嘗試進(jìn)行液化處理，在滅活標(biāo)本中加入4 倍體積4% NaOH，室溫放置10 min，12000 r/min 離心5 min，去上清后加入生理鹽水懸浮，12000 r/min 離心5 min，去上清后再用生理鹽水懸浮，12000 r/min 離心5 min，去上清后留約200 μL用于核酸提取。

1.2.3 核酸提取和加樣要求

(1)核酸提取和加樣應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成。

(2)為保證人員安全和核酸提取純度和效率，建議采用基于磁珠吸附的自動化核酸提取方法。

注意：需選用試劑盒內(nèi)配套或推薦的核酸抽提試劑。

2 場地要求

2.1 國家實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境要求

(1)具備臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)、經(jīng)過備案的生物安全二級及以上實(shí)驗(yàn)室等條件。

(2)至少參加1 次室間質(zhì)評并合格。室間質(zhì)評結(jié)果不合格的，不允許開展新冠病毒檢測。

(3)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合生物安全有關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)能有效地防止擴(kuò)增產(chǎn)物和標(biāo)本間的交叉“污染”。

2.2 醫(yī)院場地改造要求

按照衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于印發(fā)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法的通知》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194 號)的要求與實(shí)際操作步驟需要建立采樣區(qū)、試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。檢驗(yàn)科將原有的45 m2二級實(shí)驗(yàn)室劃分為3 個區(qū)域(試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū))。試劑準(zhǔn)備區(qū)13 m2，+10 Pa 的主要功能：試劑的制備和貯存、試劑的分裝、主反應(yīng)混合液的制備。樣本制備區(qū)22 m2，-15 Pa的主要功能：核酸(RNA、DNA)提取、貯存，擴(kuò)增反應(yīng)管的制作。擴(kuò)增區(qū)10 m2，-20 Pa 的主要功能：核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的測定。

采樣區(qū)設(shè)置在發(fā)熱門診附近的臨時采樣篷里。為避免交叉污染，采用全新風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)；陰陽角均用圓弧角密封處理；門必須設(shè)置自動互鎖(機(jī)械或電子)，設(shè)有專用工作服/衣柜，實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)有可視窗；在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)配備生物安全柜；設(shè)置緩沖間，緩沖間為正壓；室內(nèi)壓差值需-5 Pa～-20 Pa，見圖3。

圖3 場地設(shè)計安排Fig.3 Space design and layout

3 設(shè)備

3.1 按照二級實(shí)驗(yàn)室新冠檢測要求需要配置設(shè)備

與醫(yī)院實(shí)際情況對應(yīng)，見表1-3。

表1 準(zhǔn)備區(qū)所需的設(shè)備清單Tab.1 A list of equipments required for the staging area

3.2 需采購設(shè)備

目前需采購全自動核酸提取儀1 臺、全自動核酸檢測前處理系統(tǒng)1 臺、冰箱2 臺、氣溶膠吸附器5 臺、56 ℃水浴箱1 臺。其中自動核酸檢測前處理系統(tǒng)最為關(guān)鍵，它是核酸檢測過程中的鏈接環(huán)節(jié)。

4 核酸檢測儀性能對照

以下為各型號的核酸檢測儀的參數(shù)新冠病毒核酸檢測對比，見表4。

4.1 RNA提取方法比較

4.1.1 磁珠法核酸提取

原理：磁珠法中的細(xì)胞裂解液是一種蛋白變性劑，可使動植物的細(xì)胞裂解，并使與DNA 或RNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)變性，DNA 或RNA 游離釋放，磁珠可以特異地吸附DNA 或RNA，通過洗滌，去除DNA 或RNA 以外的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，再用洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA或RNA，得到純度和濃度均很高的DNA或RNA［3］。

主要步驟，見圖4。優(yōu)點(diǎn)：(1)能夠?qū)崿F(xiàn)自動化、大批量操作，符合生物學(xué)高通量的操作要求，使得傳染性疾病爆發(fā)時能夠進(jìn)行快速及時的應(yīng)對［4］。(2)操作簡單、用時短，整個提取流程只有4步：裂解→結(jié)合→洗滌→洗脫，大多可以在36～40 min 內(nèi)完成；(3)安全無毒，不使用傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒試劑，對實(shí)驗(yàn)操作人員的傷害減少到最少；(4)磁珠與核酸的特異性結(jié)合使得提取的核酸純度高、濃度大［5］。

表2 標(biāo)本制備區(qū)所需的設(shè)備清單Tab.2 A list of equipment required for the specimen preparation area

表3 擴(kuò)增分析區(qū)所需的設(shè)備清單Tab.3 A list of equipments required for the amplification and analysis area

4.1.2 硅膠膜吸附法核酸提取

原理：在高鹽緩沖液條件下，硅膠膜會吸附核酸，而對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類既不相親也不吸附，在經(jīng)過數(shù)次緩沖洗滌離心后，吸附在膜上的DNA 或RNA 已經(jīng)很純，這時再用適當(dāng)體積的低鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。

主要步驟，見圖5。優(yōu)點(diǎn)：吸附DNA的硅膠膜可以長期保存，為了避免DNA 的降解，在整個DNA 提取和保存的過程中操作快速、簡便、廉價。

表4 各型號的核酸檢測儀的新冠病毒核酸檢測試劑信息Tab.4 Novel coronavirus nucleic acid test reagents of different types of nucleic acid detectors（first approved）

4.2 陽性判斷Ct值

Ct 值是指在實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程中的熒光信號達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增時的循環(huán)周期數(shù)。一般情況下Ct 值越大越好。

圖4 磁珠法核酸提取步驟Fig.4 Steps for nucleic acid extraction by magnetic bead method

圖5 硅膠膜吸附法核酸提取步驟Fig.5 Steps for nucleic acid extraction by silica gel membrane adsorption method

4.3 靈敏度

靈敏度=熒光采集增量/檢測樣本增量。單位樣本采集越高，靈敏度越高，核酸檢測準(zhǔn)確率也越高。結(jié)合以上3點(diǎn)，之江生物的核酸檢測儀較為優(yōu)秀。

5 采購方案

5.1 設(shè)計采購方案

明確建設(shè)核酸檢測能力的方法后，針對我院實(shí)際情況做出2套方案。

方案一(備注：設(shè)計方案時國家衛(wèi)健委未發(fā)布公告規(guī)定必須雙靶點(diǎn)及以上)：

采購全自動核酸檢測分析系統(tǒng)，直接出檢測報告?，F(xiàn)有檢驗(yàn)科2級實(shí)驗(yàn)室條件下不用改動房屋設(shè)施，見表5。

表5 方案一情況表Tab.5 Scenario 1

方案二：

原有二級實(shí)驗(yàn)室加裝一臺全自動核酸提取儀+基因擴(kuò)增儀PCR(醫(yī)院現(xiàn)有設(shè)備)，見表6。

表6 方案二情況表Tab.6 Scenario 2

5.2 確認(rèn)采購方案

我科室與臨床科室開會討論，從效率、成本、合規(guī)性，安全性這4 個主要的方面對以上2 套方案進(jìn)行比較。

5.2.1 合規(guī)性

方案一：上海仁度單靶點(diǎn)檢測，與第5期新冠疫情要求雙靶點(diǎn)以上檢測有出入，不符合要求。之江生物Autrax 全部條件都符合。方案二：全部條件都符合，臨床科室已確認(rèn)。

上海仁度不符合國家衛(wèi)健委的要求因此不再作考慮。

5.2.2 安全性

方案一：之江Autrax 全程不開蓋操作，風(fēng)險較低。方案二：之江AutraMic 全程不開蓋操作，風(fēng)險較低；碩世到PCR 端需要重新加樣，風(fēng)險較高；達(dá)安、PE、圣湘不開蓋操作，風(fēng)險較低。碩世需人工開蓋操作，風(fēng)險較高，因此不再作考慮。

5.2.3 效率

方案一：之江Autrax 為一體機(jī)，無需PCR，樣本直接檢測，全程無泄露，需等待88 個樣本再同時檢測。方案二：為全自動核酸提取儀+PCR，一天檢測兩次，需要等待60-80樣本再同時檢測，檢測后需要消毒，影響新冠檢查工作及時性，要準(zhǔn)備大量患者等候區(qū)域。優(yōu)點(diǎn)在于試劑可以開放，疫情結(jié)束后，仍可檢測乙肝，丙肝等。

5.2.4 場地

方案一：之江Autrax 符合現(xiàn)有場地情況。方案二：之江AutraMic、PE 符合現(xiàn)有場地情況。達(dá)安、圣湘設(shè)備體積較大，不符合現(xiàn)有場地情況。

圖6 核酸檢測結(jié)果報告Fig.6 Nucleic acid test report

綜上所述，結(jié)合效率、合規(guī)性、場地與臨床科室意見等總體考慮，由于PE 沒有現(xiàn)貨，需等待2 個月，最終將方案二之江全自動核酸提取儀之江AutraMic +PCR 確定為最優(yōu)方案。并需額外采購5臺氣溶膠吸附器，放置在采樣點(diǎn)，PCR實(shí)驗(yàn)室。

在此次疫情期間，如何盡快實(shí)現(xiàn)醫(yī)院的新冠病毒核酸檢測能力是各家醫(yī)院的頭等大事。只有了解病毒原理，通過場地合理布局，產(chǎn)品性能比較，流程安全評估，設(shè)備及時采購，才能確保新冠病毒檢測工作的順利實(shí)現(xiàn)。

以下是各項(xiàng)工作完成的時間節(jié)點(diǎn)：

2020年4月18日，通知下達(dá)后，院內(nèi)任務(wù)布置，展開實(shí)地調(diào)研。

2020年5月31日，場地及設(shè)備配備到位，性能驗(yàn)證完畢。

2020年6月4日，滿分通過上海市臨床檢驗(yàn)中心審核，見圖6。

2020年6月5日，靜安區(qū)辦理核酸登記。

2020年6月10日，拿到實(shí)驗(yàn)室備案憑證。