李丹，許妍，姜軍華

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029

健胃止疼五味膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)ZZ-9378-1［1］，由干姜、訶子、紫硵砂、光明鹽、蓽茇五味藥組成，具有祛寒健胃，止疼的功效。用于胃腸痙攣，脘腹冷疼，食欲不振，寒性嘔吐，腹瀉?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下有化學(xué)鑒別，兩個(gè)薄層色譜分別以胡椒堿為對(duì)照鑒別蓽茇、以沒食子酸為對(duì)照鑒別訶子，兩個(gè)含量測(cè)定分別以胡椒堿為對(duì)照品測(cè)定蓽茇含量和以沒食子酸為對(duì)照品測(cè)定的訶子含量，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在以下問題：一是蓽茇的薄層鑒別中，原方法提取效率低，再加上含有有毒性試劑苯；二是訶子的薄層鑒別中僅以沒食子酸為對(duì)照品，不能全面反映訶子的內(nèi)在質(zhì)量；三是訶子含量測(cè)定中，僅能測(cè)到游離的沒食子酸。本研究不僅針對(duì)上述問題進(jìn)行修訂，還增加了君藥干姜的薄層鑒別，旨為提升健胃止疼五味膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器與試劑：LC-20AD 高效液相色譜儀（島津液相工作站，PDA 檢測(cè)器）；TLC Visualizer 薄層成像系統(tǒng)（瑞士Camag 公司）；色譜柱：Waters Sunfire C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Waters Symmetry C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），GRACE Alltima C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BT25S 型十萬分之一電子天平（賽多利斯）；ML204T 型萬分之一電子天平（梅特勒特里多）。沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201204，含量89.9%），干姜對(duì)照藥材（批號(hào)：120942-200907），胡椒堿對(duì)照品（批號(hào)：110775-201405），均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院。健胃止疼五味膠囊三批（烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號(hào)分別為：150902，160421，160433）；陰性樣品：取缺訶子的其余各藥材，按處方量及工藝自制；取缺干姜的原輔料，按處方量及工藝自制；陰性取缺蓽茇的原輔料，按處方量及工藝自制。硅膠G 薄層板（10 cm×20 cm,青島海洋化工有限公司）。試劑：Milli-Q 超純水，甲醇、乙腈均為色譜級(jí)，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 干姜的薄層鑒別 取本品膠囊內(nèi)容物1 g，加乙酸乙酯20 mL，回流提取30 min，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 復(fù)溶，作為樣品溶液。取干姜對(duì)照藥材0.15 g，加70%乙醇20 mL，加熱回流30 min，濾過，蒸干，加水10 mL，用乙酸乙酯20 mL 振搖提取，分取上層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 復(fù)溶，作為干姜對(duì)照藥材溶液。取陰性樣品，同法制成缺干姜陰性對(duì)照溶液。照中國(guó)藥典2015 年版四部通則0502 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取樣品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性溶液各10 μL，分別點(diǎn)于10 cm×20 cm 的硅膠G 薄層預(yù)制板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（20∶3∶1∶0.4 ）為展開劑進(jìn)行展開，展開兩次，在365 nm紫外光燈下進(jìn)行檢視。結(jié)果顯示，陰性樣品無干擾，三批樣品與干姜對(duì)照藥材色譜行為一致，且斑點(diǎn)清晰見圖1a。

2.1.2 蓽茇的薄層鑒別 取本品膠囊內(nèi)容物1 g，加無水乙醇10 mL，超聲30 min，取上清夜作為樣品溶液。另取胡椒堿對(duì)照品2 mg，置2 mL 棕色容量瓶中，加無水乙醇使溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。取陰性樣品，同法制成缺蓽茇陰性對(duì)照溶液。照中國(guó)藥典2015 年版四部通則 0502 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取樣品溶液、對(duì)照品溶液、陰性溶液各2 μL，分別點(diǎn)于10 cm×20 cm 的硅膠G 薄層預(yù)制板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-無水乙醇（8∶2∶1）為展開劑進(jìn)行展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下進(jìn)行檢視。結(jié)果顯示缺蓽茇陰性對(duì)照無干擾，三批樣品色譜在與胡椒堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)，見圖1b。

2.1.3 訶子的薄層鑒別 取本品膠囊內(nèi)容物1 g，加無水乙醇10 mL，超聲30 min，取上清夜作為樣品溶液。取訶子對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取陰性樣品，同法制成缺訶子陰性對(duì)照藥材溶液。吸取樣品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254 薄層預(yù)制板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲酸（12∶8∶1）為展開劑，進(jìn)行展開，在254 nm 紫外光燈下檢視。結(jié)果表明陰性樣品無干擾，三批樣品與訶子對(duì)照藥材色譜行為一致，且斑點(diǎn)清晰，見圖1c。

2.2 訶子的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Sunfire C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；洗脫梯度：0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）；流速：1.00 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品10 粒，精密稱定內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入4 mol/L 鹽酸溶液25 mL，水浴中加熱水解2 h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品12.80 mg（含量為89.9%），置50 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成的沒食子酸對(duì)照儲(chǔ)備液；再精密移取3 mL 上述儲(chǔ)備液至50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對(duì)照品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.2.3”中沒食子酸對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25μL，液相色譜儀進(jìn)樣分析，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定沒食子酸的峰面積，以進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程 為Y=3 231 713.844 1X-1 393.342 8，r=1.000 0。表明沒食子酸在0.013 8～0.345 2 μg 之間呈良好的線性。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3”中沒食子酸對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果沒食子酸峰面積分別為448 956、449 374、449 025、448 937、450 803、447 194，其RSD 為0.3%，表明精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行稱取樣品（批號(hào)為160433）6 份，照“2.2.1”項(xiàng)下方法，依法測(cè)定，其結(jié)果分別為6.572 7、6.386 3、6.413 2、6.581 5、6.382 1、6.386 4 mg/g，RSD 為1.5%，表明重復(fù)性好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液（批號(hào)160433）10 μL，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次，結(jié)果供試品溶液中沒食子酸在12 h 內(nèi)峰面積無明顯變化，其RSD為1.5%，結(jié)果表明樣品溶液12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 采用樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，取樣品（批號(hào)160433），適量，研勻，取約0.05 g，精密稱定，平行稱取6 份，分別置150 mL 錐形瓶中，精密加入含適量沒食子酸對(duì)照品的4 mol/L 鹽酸溶液25 mL，水浴中加熱水解2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，濾過，取續(xù)濾液，照“2.2.1”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，計(jì)算回收率，結(jié)果回收率良好，適合本品的含量測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 耐用性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下同一樣品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，再分別用三種不同型號(hào)的C18 柱（Waters Sunfire C18 柱、Waters Symmetry C18 柱、GRACE Alltima C18 柱）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果沒食子酸峰在各種色譜柱均分離良好，測(cè)得含量無顯著差異，見表2。

表2 色譜柱考察測(cè)定結(jié)果

2.2.10 樣品測(cè)定 取本品3 批，照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表13。此外再將此結(jié)果與原標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)ZZ-9378-1 含量測(cè)定項(xiàng)下訶子的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果修訂后方法所測(cè)沒食子酸為總沒食子酸的量，比原方法所測(cè)的量有10%左右的增加，見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)修訂前后沒食子酸的結(jié)果比較

3 討論

3.1 薄層色譜

本研究對(duì)蓽茇、訶子的薄層色譜方法進(jìn)行修訂，同時(shí)增加了干姜的薄層色譜方法。將蓽茇的提取式由冷浸改成了超聲，提高了提取效率，考慮到苯已經(jīng)被《中國(guó)藥典》2020 年版［2］禁用，故重新考察了展開條件，最終確定為環(huán)己烷-乙酸乙酯-無水乙醇（8∶2∶1）；為全面反映訶子的內(nèi)在質(zhì)量，將訶子的TLC 色譜中沒食子酸換成訶子對(duì)照藥材；干姜屬君藥，含有揮發(fā)油，二苯基庚烷，姜辣素等多種化學(xué)成分［4-6］，干姜味辛性熱，有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效［7,8］，故增加干姜的薄層鑒別，更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

三個(gè)薄層色譜條件均考察了不同溫度（8.0 ℃，25 ℃，35 ℃）、濕度（32%，50%，72%）、不同廠家和型號(hào)的薄層板（自制的硅膠G 板與GF254板，上海東方G 板與GF254 板，青島海洋G 板與GF254 薄層板），結(jié)果顯示不同溫度、濕度，不同薄層板對(duì)分離效果無影響。

3.2 訶子的含量測(cè)定

關(guān)于沒食子酸的含量有較多報(bào)道［9-11］，本文中通過對(duì)沒食子酸在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在217 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，但為末端吸收，樣品中峰雜質(zhì)大，參照《中國(guó)藥典》2015 年版一部［3］五倍子的沒食子酸含量測(cè)定項(xiàng)，故確定273 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。參考中國(guó)藥典2015 年版一部“五倍子”標(biāo)準(zhǔn)，采用4 mol/L 鹽酸水解測(cè)總沒食子酸的方法。此外，還考察了提取溶劑體積（10、25、50 mL）、提取時(shí)間（1、2、4 h），結(jié)果表明提取溶劑體積為25 mL 和50 mL 時(shí)相差不大，提取時(shí)間 2 h 基本水解完全。最終確定了測(cè)定條件采用4 mol/L 鹽酸作為提取溶劑，提取體積為25 mL、提取時(shí)間為2 h，檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm。