任琦，游媛，洪挺，趙雯，許妍，萬(wàn)林春

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029

柏子養(yǎng)心丸為國(guó)家基本藥物，處方由炙黃芪、黨參、川芎、當(dāng)歸、柏子仁、酸棗仁、制遠(yuǎn)志、醋五味子、肉桂、茯苓、半夏曲、朱砂、炙甘草十三味藥組成。具補(bǔ)氣、養(yǎng)血、安神之功效。用于心氣虛寒、心悸易驚、失眠多夢(mèng)，健忘等癥［1］。

柏子養(yǎng)心丸療效確切，臨床應(yīng)用廣泛［2-5］。方中炙黃芪、黨參合為君藥；當(dāng)歸、川芎、柏子仁為臣藥；酸棗仁、遠(yuǎn)志、五味子、肉桂、茯苓、半夏、朱砂共為佐藥；甘草為使藥［6］。全方通過(guò)不同活性成分群之間發(fā)揮協(xié)同作用，共奏補(bǔ)氣、養(yǎng)血、安神之效。因此，方中藥材的穩(wěn)定性對(duì)于制劑的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)也極大地影響著臨床使用的安全性及有效性［7］。近年來(lái)，指紋圖譜技術(shù)能夠全面、準(zhǔn)確、整體的反映制劑整體質(zhì)量，現(xiàn)已廣泛地運(yùn)用于制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)［8］。目前，關(guān)于柏子養(yǎng)心丸指紋圖譜的研究主要集中在毛細(xì)管指紋圖譜［9］、數(shù)字化指紋圖譜［10］及比率指紋圖譜［11］等，但由于柏子養(yǎng)心丸中藥味多、成分種類各異，其紫外吸收波長(zhǎng)不一，在同一波長(zhǎng)下不能同時(shí)呈現(xiàn)在同一液相指紋圖譜中。故本文建立多波長(zhǎng)切換HPLC指紋圖譜［12-15］更能準(zhǔn)確、直觀反映多組分下色譜峰的信息，為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制柏子養(yǎng)心丸的質(zhì)量提供可靠方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 系列高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Sartorius BSA 124S-CW 電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；Sartorius BT 25S電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KQ-500DE 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201313）、桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)：110710-201217）、五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：110857-201412）、五味子酯甲對(duì)照品（批號(hào)：111529-200503）、五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)：110764-200107）、五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)：110765-200508）、川芎對(duì)照藥材（批號(hào)：120918-201411）、當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)：120927-201516）、肉桂對(duì)照藥材（批號(hào)：121363-201102）、五味子對(duì)照藥材（批號(hào)：120922-201309）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；洋川芎內(nèi)酯A 對(duì)照品（批號(hào)：141204）、Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：150604）均購(gòu)自上海胤珂生物科技有限公司。甲醇為色譜純；乙腈為色譜純；水為Milli-Q 制備的純化水；其他試劑為分析純。30批柏子養(yǎng)心丸來(lái)源于5 個(gè)企業(yè)（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)：15035315、15035306、15035305、15035173、15035171、15035168，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020080，規(guī)格：每100 粒重10 g；江西藥都樟樹(shù)制藥有限公司，批號(hào)：150403、150401、150503、150402、150406、150411，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z36021835，規(guī)格：每瓶裝60 g；九芝堂股份有限公司，批號(hào)：201507042、201507041、201504014、201504001、201507042、201504004，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z43020150，規(guī)格：每瓶裝120 g；南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：140909、140203、150402、150307、150305、150403，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020029，規(guī)格：每瓶裝60 g；蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1503071、1503101、1505221、1504151、1504211、1501101，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z34020946，規(guī)格：每瓶裝36 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸、桂皮醛、洋川芎內(nèi)酯A、五味子醇甲、Z-藁本內(nèi)酯、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL 含20 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品水蜜丸研碎；小蜜丸剪碎，混勻，取本品約6 g，精密稱定，精密加50%乙醇25 mL，置具塞錐形瓶中，稱定重量，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～70.0 min，20%→80% A；70.0～85.0 min，80.0% A；85.01～95.0 min，20% A）；流速為1.0 mL/min；波長(zhǎng)切換（0～31 min，335 nm；31～52.5 min，285 nm；52.5～85 min，215 nm）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 指紋峰指認(rèn)

取“2.1”項(xiàng)下參照物溶液進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 空白溶劑試驗(yàn)

取50%乙醇，采用“2.2”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示空白溶劑在色譜圖中未出現(xiàn)與供試品溶液相應(yīng)的色譜峰。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.5 精密度試驗(yàn)

取柏子養(yǎng)心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)：15035315）1 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定，記錄各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。以4 號(hào)色譜峰的保留時(shí)間及積分峰面積為參照，計(jì)算樣品中主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并求出對(duì)應(yīng)的RSD%和平均值，并計(jì)算精密度試驗(yàn)相似度。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的比值較穩(wěn)定（RSD ＜1%）；相對(duì)峰面積比值較穩(wěn)定（RSD ＜5%），圖譜相互間相似度均大于0.90，表明本測(cè)定方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取柏子養(yǎng)心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)：15035315）6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣，分別于0、2、4、12、24 h測(cè)定指紋圖譜，記錄各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。以4 號(hào)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)峰面積比值較穩(wěn)定（RSD ＜5%）；相對(duì)保留時(shí)間的比值較穩(wěn)定（RSD ＜1%），圖譜相互間相似度均大于0.90，表明本測(cè)定方法至少在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取柏子養(yǎng)心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)：15035315）6 份，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣，測(cè)定，記錄各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。以4 號(hào)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算重現(xiàn)性試驗(yàn)相似度。結(jié)果表明：各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的比值較穩(wěn)定（RSD ＜1%）；相對(duì)峰面積比值較穩(wěn)定（RSD ＜5%），圖譜相互間相似度均大于0.90，表明本測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。

2.8 對(duì)照指紋圖譜的建立

從5 個(gè)生產(chǎn)廠家中選取3 批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣，測(cè)定，記錄色譜圖。將15批樣品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 年版，選取“時(shí)間窗寬度”為0.10 min，對(duì)照?qǐng)D譜的生成方法為“中位數(shù)”，自動(dòng)匹配后，得到柏子養(yǎng)心丸多波長(zhǎng)切換HPLC 對(duì)照指紋圖譜。色譜圖見(jiàn)圖3。

2.9 柏子養(yǎng)心丸與原藥材之間的相關(guān)性分析

取川芎、當(dāng)歸、肉桂、五味子對(duì)照藥材適量，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣，測(cè)定，記錄色譜圖。通過(guò)色譜峰對(duì)比，確定了8 個(gè)色譜峰為特征峰，其中峰1、5 為屬川芎及當(dāng)歸藥材特征峰；峰3 為屬川芎特征峰；峰2 為屬肉桂特征峰、峰4、6、7、8為五味子特征峰。色譜圖見(jiàn)圖4。

2.10 成品指紋圖譜的測(cè)定

按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備30 批柏子養(yǎng)心丸供試品溶液并測(cè)定，所得指紋圖譜分別與對(duì)照指紋圖譜用相似度軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果30 批次樣品的指紋圖譜相似度均＞0.9，相似度良好。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于柏子養(yǎng)心丸成分的復(fù)雜性和多樣性，不同的化學(xué)成分紫外吸收波長(zhǎng)不同。阿魏酸的最大吸收波長(zhǎng)為（323±2）nm，桂皮醛的最大吸收波長(zhǎng)為（291±2）nm，洋川芎內(nèi)酯A 的最大吸收波長(zhǎng)為（282±2）nm，五味子醇甲的最大吸收波長(zhǎng)為（215±2）nm、Z-藁本內(nèi)酯的最大吸收波長(zhǎng)為（206±2）nm、五味子酯甲的最大吸收波長(zhǎng)為（221±2）nm、五味子甲素的最大吸收波長(zhǎng)為（215±2）nm、五味子乙素的最大吸收波長(zhǎng)為（215±2）nm，為使各峰的響應(yīng)值均較大，最終確定按照“2.2”項(xiàng)下檢測(cè)波長(zhǎng)切換條件。

3.2 流速相系統(tǒng)及比例的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、甲醇-0.5%甲酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液7 個(gè)不同流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)優(yōu)于乙腈-水系統(tǒng)，其中以甲醇-0.1%甲酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)分離度好且基線平穩(wěn)。并對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化，最終確定按照“2.2”項(xiàng)下梯度洗脫的流動(dòng)相比例。

3.3 供試品溶液制備的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取方式（超聲處理15、30、60、90 min，加熱回流60 min），結(jié)果兩種提取方式供試品均能達(dá)到良好的分離，考慮操作方便并節(jié)省時(shí)間，故確定本品提取方法為超聲處理30 min。同時(shí)考察了不同提取溶劑種類（50%甲醇、50%乙醇、甲醇、乙醇），結(jié)果四種溶劑提取供試品均能達(dá)到良好的分離，其中50%乙醇各組分響應(yīng)較大且更加環(huán)保，故確定50%乙醇為提取溶劑。

3.4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立柏子養(yǎng)心丸多波長(zhǎng)切換HPLC 指紋圖譜，共有8 個(gè)共有峰，所對(duì)應(yīng)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，方法學(xué)考察表明精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 年版，計(jì)算出相似度符合國(guó)家相關(guān)要求，為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制柏子養(yǎng)心丸的質(zhì)量提供可靠方法。