楊陳 曹小瑤 劉明宗 高榕茂

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院(東院)ICU，四川 成都 610101)

急性胰腺炎(AP)是臨床常見疾病且病死率極高，根據疾病嚴重程度分為輕度、中度及重度，其中重度AP患者預后較差且常伴隨多種并發(fā)癥導致患者死亡率升高〔1〕。胰腺腺泡細胞凋亡是AP發(fā)生及發(fā)展的重要因素，從防止胰腺腺泡細胞凋亡及促進細胞增殖的角度進行干預及治療成為研究熱點〔2〕。微小RNA(miRNA)異常表達可通過調控靶基因表達進而參與AP發(fā)生及發(fā)展過程〔3〕。研究表明，miR-324-5p在重度AP患者外周血中低表達，同時在缺氧/復氧心肌細胞損傷過程中miR-324-5p下調表達并可抑制心肌細胞凋亡〔4,5〕。然而關于miR-324-5p在AP腺泡細胞增殖及凋亡過程中的可能作用機制研究未見報道。通過靶基因網站預測到胱天蛋白酶募集域蛋白(CARD)9可能是miR-324-5p的靶基因，研究顯示早期AP患者外周血CARD9蛋白和mRNA表達顯著升高，且CARD9的表達水平與胰腺炎嚴重程度呈正相關〔6,7〕。但miR-324-5p和CARD9對AP腺泡細胞增殖、凋亡的影響，且miR-324-5p是否通過調控CARD9表達影響AP腺泡細胞增殖、凋亡目前還尚未可知。本研究通過雨蛙肽素處理大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J，觀察miR-324-5p表達變化對AR42J細胞增殖及凋亡的影響，驗證其與CARD9的靶向作用關系進而為提高臨床AP治療效果提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胰腺腺泡細胞株AR42J購自美國American Type Culture Collection公司。雨蛙肽購自美國Sigma-Aldrich公司。CARD9 siRNA、si-NC均購自美國GeneCopopia公司；CARD9過表達慢病毒及其對照病毒均購自Polybrene Hanbio公司；miR-NC、miR-324-5p mimic、anti-miR-NC、miR-324-5p抑制劑(anti-miR-324-5p)均購自上海吉瑪基因公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Gibco公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海普盛生物公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒、Trizol 試劑盒均購自美國Invitrogen 公司；Lipofectamine2000轉染試劑、反轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒均購自美國ABI公司；熒光素酶報告基因載體購自美國Invitrogen 公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；兔抗鼠活化的酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、B 細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2，Bcl-2 相關 X 蛋白(Bax)抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgGⅡ抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；RIPA細胞裂解液購自上海生物工程股份有限公司；兔抗鼠CARD9、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27抗體均購自美國CST公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京威格拉斯生物技術有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及AP細胞模型構建 將AR42J細胞培養(yǎng)于含有10% FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。構建AP模型〔8〕：造模前1 d，取AR42J細胞接種于6孔板(5.5×104個細胞/孔)，加入RPMI1640培養(yǎng)基1 ml/孔，放入恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，加入濃度為100 nmol/L的雨蛙肽刺激細胞6 h，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集上清液采用ELISA檢測TNF-α、IL-6濃度。

1.3細胞轉染及分組 未經雨蛙肽作用的AR42J細胞為對照組，雨蛙肽刺激的AR42J細胞為雨蛙肽組。轉染前1 d將雨蛙肽刺激的AR42J細胞接種于6孔板(5.5×105個細胞/孔)，隨機分為雨蛙肽+miR-NC組、雨蛙肽+miR-324-5p組、雨蛙肽+si-NC組、雨蛙肽+si-CARD9組、雨蛙肽+miR-324-5p+pcDNA組、雨蛙肽+ miR-324-5p+pcDNA-CARD9組。轉染時分別用不含FBS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉染試劑、miR-NC、miR-324-5p mimic、si-NC、si-CARD9、pcDNA、pcDNA-CARD9，稀釋至濃度為100 nmol/L，參照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書進行操作，轉染6 h后更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4qRT-PCR檢測細胞中miR-324-5p及CARD9 mRNA表達水平 收集各組AR42J細胞，PBS洗滌，分別加入Trizol試劑提取細胞總RNA，RNA定量后反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，20 μl反應體系分別為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，上下游引物各0.5 μl/孔，ddH2O 8 μl/孔。qRT-PCR擴增條件為循環(huán)1次(95℃ 6 min)，95℃變性15 s循環(huán)40次，60℃退火60 s循環(huán)40次。miR-324-5p以U6為內參基因，CARD9以GAPDH為內參基因，反應結束后得到各孔樣品Ct值，采用2-ΔΔCt算法計算miR-324-5p、CARD9 mRNA相對表達量。

1.5Western印跡檢測CARD9、CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、酶切caspase-3蛋白表達 收集各組AR42J細胞，預冷PBS洗滌細胞，分別加入RIPA細胞裂解液，提取蛋白，蛋白樣品定量后加入1倍蛋白電泳緩沖液，以50 μg/孔蛋白樣本加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)槽內，SDS-PAGE反應條件為80 V 30 min，120 V 90 min，電泳結束后應用半干法將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入含有5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入各蛋白一抗(1∶1 000)，4℃條件下孵育24 h，用TBST洗滌3次，15 min/次，置于二抗(1∶2 000)中反應2 h，TBST洗滌后加入增強型化學發(fā)光試劑(ECL)進行顯色反應，置于凝膠電泳成像儀進行掃描，各蛋白均以GAPDH為內參基因，應用Quantity One軟件分析各蛋白相對表達量。

1.6MTT檢測細胞增殖 收集各組轉染后24 h、48 h、72 h 的AR42J細胞，胰酶消化后接種至96孔板，每孔分別加入質量濃度為5 mg/ml的MTT試劑20 μl，培養(yǎng)2 h后棄上清，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后應用酶標儀檢測490 nm波長處的各孔吸光度(OD)值。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集對數生長期AR42J細胞，利用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒進行染色，避光條件下依次分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，振蕩混勻10 min，上流式細胞儀檢測各組AR42J細胞凋亡情況，細胞凋亡率=(早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞)/細胞總數×100%。

1.8雙熒光素酶報告基因實驗 分別構建含有野生型CARD9 3′UTR序列的熒光素酶報告基因質粒WT-CARD9與含有突變型CARD9 3′UTR序列的熒光素酶報告基因質粒MUT-CARD9，收集未經雨蛙肽處理的對數生長期AR42J細胞，用含有10%FBS及雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋AR42J細胞，調整細胞密度為2×105/ml，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，分別將WT-CARD9、MUT-CARD9質粒與miR-324-5p mimic或陰性對照共轉染至AR42J細胞，每組均設置3次重復，置于恒溫培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h，應用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細胞相對熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1對照組與雨蛙肽組TNF-α、IL-6水平比較 對照組TNF-α、IL-6濃度(123.15±11.32)ng/L、(102.14±16.57)ng/L，雨蛙肽組為(316.23±16.47)ng/L、(358.42±18.36)ng/L，雨蛙肽刺激后AR42J細胞TNF-α、IL-6濃度均顯著升高(P<0.05)，提示造模成功。

2.2miR-324-5p和CARD9在胰腺炎腺泡細胞AR42J中的表達 雨蛙肽組胰腺炎腺泡細胞AR42J中miR-324-5p表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，而CARD9 mRNA及蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)。見圖1，表1。

2.3miR-324-5p過表達對胰腺炎腺泡細胞AR42J增殖的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，轉染miR-324-5p mimic的AR42J細胞miR-324-5p表達顯著上調(P<0.05)，提示成功提高雨蛙肽誘導的AR42J細胞中miR-324-5p的表達水平。MTT檢測細胞增殖情況，結果發(fā)現雨蛙肽可降低AR42J細胞增殖活性(P<0.05)，而轉染miR-324-5p mimic后可增強AR42J細胞增殖活性(P<0.05)。Western印跡結果顯示，雨蛙肽處理后CyclinD1蛋白表達顯著下調(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達顯著上調(P<0.05)，miR-324-5p 過表達后CyclinD1蛋白表達顯著上調(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達顯著下調(P<0.05)，見圖2，表2。

圖1 CARD9蛋白表達

表1 miR-324-5p和CARD9在胰腺炎腺泡細胞AR42J中的表達

圖2 增殖相關蛋白表達

表2 miR-324-5p過表達對胰腺炎腺泡細胞AR42J增殖的影響

2.4miR-324-5p過表達對胰腺炎腺泡細胞AR42J凋亡的影響 雨蛙肽組AR42J細胞凋亡率較對照組明顯升高(P<0.05)，而miR-324-5p過表達后AR42J細胞凋亡率較雨蛙肽+miR-NC組明顯降低(P<0.05)。Western印跡結果顯示，與對照組比較，雨蛙肽組AR42J細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax、酶切caspase-3表達水平顯著升高(P<0.05)；與雨蛙肽+si-NC組比較，雨蛙肽+si-CARD9組Bcl-2蛋白表達顯著上調(P<0.05)，而Bax、酶切caspase-3蛋白表達顯著下調(P<0.05)。見圖3，表3，圖4。

圖3 細胞凋亡流式圖

表3 miR-324-5p過表達對胰腺炎腺泡細胞AR42J凋亡的影響

圖4 凋亡相關蛋白表達

2.5抑制CARD9表達對胰腺炎腺泡細胞AR42J增殖和凋亡的影響 Western印跡實驗結果顯示雨蛙肽+si-CARD9組AR42J細胞中CARD9蛋白表達水平顯著低于雨蛙肽+si-NC組(P<0.05)，提示成功抑制胰腺炎腺泡細胞AR42J中CARD9的高表達。MTT與流式細胞儀結果顯示，與雨蛙肽+si-NC組比較，雨蛙肽+si-CARD9組AR42J 48、72 h細胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，而細胞凋亡率明顯減少(P<0.05)，同時Western印跡檢測結果顯示雨蛙肽組p21、 Bax蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，而CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水均顯著降低于對照組(P<0.05)；雨蛙肽+si-CARD9組AR42J細胞CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水顯著高于雨蛙肽+si-NC組(P<0.05)，而p21、 Bax蛋白表達水顯著低于雨蛙肽+si-NC組(P<0.05)，見圖5、表4。

圖5 CARD9和增殖、凋亡相關蛋白表達

表4 抑制CARD9表達對胰腺炎腺泡細胞AR42J增殖和凋亡的影響

2.6miR-324-5p靶向調控CARD9的表達 雙熒光素酶活性檢測結果顯示，CARD9的3′UTR中含有與miR-324-59互補的核苷酸序列(圖6)；與轉染miR-NC比較，共轉染miR-324-5p mimic與WT-CARD9野生質?？墒辜毎麩晒馑孛富钚悦黠@降低(P<0.05)；而共轉染miR-324-5p mimic與MUT-CARD9突變型質粒后細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。抑制miR-324-5p表達后CARD蛋白表達水平(0.81±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.42±0.05)(P<0.05)，miR-324-5p過表達后CARD蛋白表達水平(0.18±0.03)顯著低于miR-NC組(0.45±0.04)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

2.7CARD9過表達逆轉了miR-324-5p過表達對雨蛙肽誘導的胰腺炎腺泡細胞AR42J增殖和凋亡的作用 Western印跡檢測結果顯示，雨蛙肽+ miR-324-5p+pcDNA-CARD9組AR42J細胞CARD9蛋白表達相較于雨蛙肽+miR-324-5p+pcDNA組明顯升高(P<0.05)。進一步研究發(fā)現共轉染miR-324-5p mimic與pcDNA-CARD9后AR42J 48、72 h細胞增殖活性顯著降低，而細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而p21、Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表6、圖8。

圖6 CARD9的3′UTR中含有與miR-324-5p互補的核苷酸序列

1～4：miR-NC組,miR-324-5p組,anti-miR-NC組,anti-miR-324-5p組圖7 miR-324-5p靶向調控CARD9的表達

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 CARD9過表達逆轉了miR-324-5p過表達對雨蛙肽誘導的胰腺炎腺泡細胞AR42J增殖和凋亡的作用

1～4：miR-NC組,miR-324-5p組,miR-324-5p+pcDNA組,miR-324-5p+pcDNA-CARD9組圖8 CARD9和增殖、凋亡相關蛋白表達

3 討 論

AP發(fā)病迅速且疾病進展較快，目前尚無治療AP的有效方法，研究顯示AP發(fā)生及發(fā)展過程涉及多基因或多條信號通路調控，胰腺腺泡細胞增殖及凋亡與AP疾病嚴重程度密切相關，而AP發(fā)生及發(fā)展與miRNAs異常表達有關，其根本原因在于miRNAs異常表達可促使胰腺組織發(fā)生炎癥反應發(fā)生進而參與疾病進展過程〔9,10〕。因此著重分析miRNAs與胰腺腺泡細胞增殖及凋亡的作用關系具有重要意義。

miR-324-5p在肝細胞癌組織及細胞中均呈低表達并可發(fā)揮抑癌作用，研究表明上調miR-324-5p表達可降低肝癌細胞增殖遷移及侵襲能力，沉默miR-324-5p表達可促進肝癌細胞遷移及侵襲〔11〕。研究表明miR-324-5p可在多種惡性腫瘤中均發(fā)揮抑癌基因作用，并可為癌癥的精準治療提供潛在靶點〔12〕。Rider等〔13〕研究表明miR-324-5p在肺炎患者中呈低表達，并可作為臨床診斷肺炎的標志物。但miR-324-5p在AP疾病發(fā)生及發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究結果說明miR-324-5p表達水平降低可能是AP發(fā)生的原因之一。通過將miR-324-5p mimic轉染至AR42J細胞以此上調miR-324-5p表達，結果發(fā)現miR-324-5p過表達后AR42J細胞增殖活性顯著增強，CyclinD1蛋白表達水平明顯升高，而p21、p27蛋白表達水平明顯降低，CyclinD1可通過與CDK4/6結合而調控細胞周期進而促使細胞進入S期，p21、p27又可抑制CyclinD1與CDK4/6結合進而誘導細胞停滯于G1期〔14〕。提示上調miR-324-5p表達可降低p21、p27表達水平促進CyclinD1與CDK4/6結合并促進細胞進入S期促進細胞增殖。同時本研究發(fā)現上調miR-324-5p表達后可緩解雨蛙肽素誘導的細胞凋亡情況，即miR-324-5p過表達可抑制胰腺炎腺泡細胞AR42J凋亡，檢測線粒體途徑相關蛋白表達。Bcl-2蛋白表達水平升高可通過抑制線粒體凋亡途徑活化進行抑制細胞凋亡，Bax蛋白表達水平升高可通過促使Cyt-C穿過線粒體膜而激活線粒體凋亡途徑進而激活酶切caspase-3蛋白導致細胞凋亡〔15,16〕。提示miR-324-5p過表達可降低雨蛙肽素誘導的AR42J細胞凋亡水平，抑制凋亡因子。

CARD9屬于CARD蛋白家族成員，研究表明CARD9可通過調節(jié)細胞內信號轉導途徑進而參與感染性疾病等發(fā)生及發(fā)展過程〔17〕。研究表明AP發(fā)展過程中涉及單核-巨噬細胞激活，CARD9在巨噬細胞中高表達并可通過與Bcl-10結合進而激活下游轉錄因子-核因子(NF-κB)等信號通路，而NF-κB信號通路激活可加重AP疾病嚴重程度〔18,19〕。許宏敏〔20〕研究表明老年AP患者單核細胞中CARD9表達水平升高并可通過激活NF-κB信號通路進而形成炎癥因子。沉默CARD9可抑制NF-κB和P38MAPKs途徑進而減輕大鼠重癥AP，CARD9過表達可加重AP疾病嚴重程度〔21,22〕。本研究結果說明CARD9表達水平升高可能是誘發(fā)AP的主要原因。進一步研究發(fā)現抑制CARD9表達后可提高胰腺炎腺泡細胞AR42J增殖活性，降低AR42J細胞凋亡率。本研究采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證CARD9是miR-324-5p的靶基因，上調miR-324-5p表達可抑制CARD9表達，同時為明確miR-324-5p是否通過靶向CARD9而影響AR42J細胞增殖及凋亡能力，通過轉染miR-324-5p mimic與pcDNA-CARD9共轉染至雨蛙肽誘導的AR42J細胞中，結果說明上調miR-324-5p可通過抑制CARD9表達進而促進AR42J細胞增殖，降低雨蛙肽誘導的AR42J細胞凋亡率，其可能是通過上調CyclinD1、Bcl-2蛋白表達及下調p21、 Bax蛋白表達實現的。提示miR-324-5p過表達可抑制靶基因CARD9表達進而促進胰腺炎腺泡細胞增殖，抑制細胞凋亡。

綜上，miR-324-5p與CARD9存在靶向關系，miR-324-5p可通過靶向調控CARD9表達促進胰腺炎腺泡細胞增殖并抑制細胞凋亡。但關于miR-324-5p是否同時靶向其他下游靶基因及其可能作用信號通路均有待進一步研究。