羅 燮，曾 粒，袁 磊*

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科； 2.腎內(nèi)科， 重慶 400010)

肥胖(obesity)是一個重要的公共健康問題，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和壽命[1]。藥物治療對于控制肥胖十分重要，但目前上市的減肥藥物主要通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制食欲，或者通過胃腸道系統(tǒng)，抑制能量吸收達(dá)到治療肥胖的效果[2]。目前尚沒有直接作用于脂肪細(xì)胞來調(diào)控體質(zhì)量從而治療肥胖的藥物。白色脂肪細(xì)胞是經(jīng)典脂肪細(xì)胞，可儲存體內(nèi)過多的能量，引起肥胖。棕色脂肪細(xì)胞因含有大量線粒體，以產(chǎn)熱的形式消耗能量，可對抗肥胖。研究表明白色脂肪細(xì)胞在特定條件下可向棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)熱耗能，增加代謝活性，這一轉(zhuǎn)化的過程稱為白色脂肪細(xì)胞棕色化/米色化[3-5]。即使是極少量的棕色/米色脂肪細(xì)胞，也可獲得極大的質(zhì)量及代謝收益[6]。代謝型谷氨酸受體(mGluRs) 主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與焦慮、抑郁、疼痛、帕金森等多種神經(jīng)精神疾病相關(guān)，其在外周也有一定的表達(dá)和作用[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)mGluR5拮抗劑可在不改變小鼠食欲情況下，使小鼠體質(zhì)量下降，脂肪減少[8]。本研究證明mGluR5拮抗劑可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞表達(dá)棕色脂肪特異性基因，增強(qiáng)呼吸氧耗率和脂肪分解能力，促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞的代謝改變，為治療肥胖提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動物：小鼠白色脂肪前體細(xì)胞系(3T3L1細(xì)胞，ATCC公司); SPF級6～8周雄性C57BL/6小鼠5只，體質(zhì)量20～23 g [重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號: scxk(渝)2012-0001]。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清BS(Gibco公司)；胎牛血清FBS、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、牛胰島素、磷酸鹽緩沖液、二甲基亞砜(DMSO)、氯化鈉、乙醇、BODIPY 493/503、Triton分析純試劑、DL-二硫蘇糖醇、硫酸鎂分析純試劑和Trizol試劑盒(Invitrogen公司)；ECL發(fā)光液(Bio-Rad公司)；RT-PCR試劑盒(Applied Biosystems公司)；iTaq Universal SYBR Green Super Master Mix(Bio-Rad公司)；兔抗mGluR5一抗、驢抗兔抗體二抗(Abcam公司)；MPEP hydrochloride、SIB 1893、游離甘油試劑盒(Sigma-Aldrich公司);XF24 extracellular flux assay kits(Seahorse Bioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 3T3L1細(xì)胞的培養(yǎng)、分化及處理：將白色脂肪前體細(xì)胞3T3L1誘導(dǎo)分化至第9天，用mGluR5拮抗劑MPEP、SIB處理細(xì)胞，DMSO作為對照，每2 d處理1次，共處理細(xì)胞4次，8 d后收集細(xì)胞。

1.2.2 Western blot檢測小鼠脂肪組織mGluR5蛋白的表達(dá): 提取小鼠 (n=5) 腹股溝白色脂肪組織(subcutaneous white adipose tissues, SubWAT)，附睪脂肪組織(epididymal white adipose tissues, EpiWAT)，棕色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)，胰腺組織(pancreas, 陰性對照)，嗅泡組織 (olfactory bulb，陽性對照)，使用裂解液裂解并提取組織蛋白，測定蛋白濃度，然后進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用牛奶封閉后一抗孵育過夜，TBST洗3次后進(jìn)行二抗孵育 2 h，TBST洗膜后ECL顯色，并置于Bio-rad成像儀中曝光，后定量分析條帶。

1.2.3 脂滴BODIPY染色：3T3L1細(xì)胞分化處理后，棄細(xì)胞液，PBS洗滌，甲醛固定細(xì)胞，加入BODIPY 493/503溶液，脂滴染色20 min，棄染色液后PBS洗滌，DAPI染色。熒光顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞脂滴變化，脂滴被BODIPY 493/503染色，發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞核被DAPI染色，發(fā)出藍(lán)色熒光。

1.2.4 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)：使用Trizol法提取處理后3T3L1細(xì)胞mRNA, 檢測RNA濃度，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再以mTBP作為內(nèi)參，以cDNA為模板，通過SYBR Green檢測各基因的相對表達(dá)。各特異性引物的基因分別為:mTBP(上游：5′-GAAGCT GCGGTACAATTCCAG-3′,下游：5′-CCCCTTGTACC CTTCACCAAT-3′);CP1(上游：5′-ACTGCCACACCT CCAGTCATT-3′,下游：5′-CTTTGCCTCACTCAGGA TTGG-3′);AP2(上游：5′-ACACCGAGATTTCCTTC AAACTG-3′,下游：5′-CCATCTAGGGTTATGATGCT CTTC-3′);PRDM16(上游：5′-TCTTACTTCTCCGA GATCCGAAA-3′,下游：5′-GATCTCAGGCCGTTTGTC CAT-3′);Nrf1(上游：5′-AGCACGGAGTGACCCAA AC-3′,下游：5′-TGTACGTGGCTACATGGACCT-3′);Tfam(上游：5′-ATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCA3′,下游：5′-TCTGAAAGTTTTGCATCTGGGT-3′);Tfb2m(上游：5′-GGCCCATCTTGCATTCTAGGG-3′,下游：5′-CAGGCAACGGCTCTATATTGAAG-3′);Polg(上游：5′-GGCTGACCTAACCCCTTTGG-3′,下游：5′-CTGTT CCCTGATATGGGCTCG-3′);Cox3(上游：5′-TCCAAGTCCATGACCATTAACTG-3′,下游：5′-TAT TTGGTGAGTAGGCCAAGGG-3′);mtND1(上游：5′-GAGCATCTTATCCACGCTTCC-3′,下游：5′-GTACTC CCGCTGTAAAAATTGGT-3′);Cpt1(上游：5′-CTCC GCCTGAGCCATGAAG-3′,下游：5′-CACCAGTGAT GATGCCATTCT-3′)。

1.2.5 細(xì)胞耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)的測定: 用Seahorse檢測OCR，可反應(yīng)細(xì)胞呼吸情況。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.8×104個/mL，加入至XF24 細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液;用于調(diào)整背景信號的孔(A1, B4, C3, D6)中加入培養(yǎng)液(不含細(xì)胞)。培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)分化后MPEP, SIB及 DMSO處理細(xì)胞。測試前移除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入XF分析培養(yǎng)基，37 ℃無CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。將寡霉素(oligomycin, oligo)，線粒體解偶聯(lián)劑：羰基-氰-對-三氟甲氧基本腙(carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone，F(xiàn)CCP), 抗霉素A和魚藤酮 (antimycin A & rotenone)和XF分析培養(yǎng)基分別加入藥物注射槽中，校正儀器后，置入準(zhǔn)備好的細(xì)胞，按程序設(shè)定加入oligo、FCCP和antimycin A & rotenone進(jìn)行測量，空白對照中加入XF分析培養(yǎng)基。記錄每個孔15個點的OCR值。完成測定后立即用甲醛固定細(xì)胞，用DAPI染色。用 image J軟件分析細(xì)胞總數(shù)。每孔的OCR測量值用細(xì)胞總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。Oligo是ATP合酶抑制劑，加入oligo之前的OCR值為基礎(chǔ)呼吸，包括線粒體氧化磷酸化及質(zhì)子漏耗氧。加入oligo后OCR值代表質(zhì)子漏耗氧，減少的OCR代表機(jī)體用于ATP合成的呼吸，F(xiàn)CCP是一種解偶聯(lián)劑，使質(zhì)子大量漏過線粒體膜，加入FCCP后OCR值代表細(xì)胞最大呼吸耗氧能力。而抗霉素A和魚藤酮(antimycin，rotenone)是呼吸鏈抑制劑，可完全抑制線粒體耗氧。

1.2.6 游離甘油釋放試驗(free glycerol release assay)：MPEP及SIB處理后的細(xì)胞加入PBS洗滌，移除PBS，加入等量含或不含毛喉素 (forskolin，F(xiàn)SK) 的Hank平衡鹽溶液(HBSS)，饑餓處理，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，收集HBSS。用游離甘油試劑盒檢測甘油含量。根據(jù)操作步驟做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將 100 μL游離甘油試劑加入至2.5 μL收集的HBSS及標(biāo)準(zhǔn)液中，搖晃30 s，37 ℃孵育5 min，讀取A540吸光度值。收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，檢測蛋白濃度。每孔用蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化甘油釋放量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 mGluR5 在脂肪組織中表達(dá)

小鼠BAT、SubWAT、EpiWAT均表達(dá)mGluR5，olfactory bulb(陽性對照)大量表達(dá)mGluR5，pancreas極少量表達(dá)mGluR5 (陰性對照)。mGluR5在白色脂肪組織的表達(dá)特別是附睪脂肪組織比在棕色脂肪組織的表達(dá)顯著增加 (圖 1)。

*P<0.05 compared with BAT group圖1 mGluR5在不同組織的表達(dá)Fig 1 mGluR5 expressed in different n=5)

2.2 mGluR5調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂滴形態(tài)

mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)可調(diào)節(jié)分化成熟的3T3L1細(xì)胞形態(tài)。與對照組相比，mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)處理后脂肪細(xì)胞脂滴體積減小，數(shù)量增加(圖2)。

2.3 mGluR5調(diào)節(jié)棕色脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)

mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)可在3T3L1細(xì)胞中顯著促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞重要調(diào)控基因UCP1，PRDM16，PGC1α的表達(dá)(P<0.05)，而對脂肪細(xì)胞發(fā)育的代表性基因AP2沒有明顯影響(圖3)。

2.4 mGluR5調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)基因的表達(dá)

線粒體生成合成核呼吸因子(NRF1)，線粒體編碼轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)，線粒體編碼轉(zhuǎn)錄因子B2(TFB2M)，線粒體DNA聚合酶(POLG), 細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅲ(COX3), 還原型NADH泛醌氧化還原型亞基1(MTND1), 和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)酶-Ⅰ(CPT1)是線粒體合成與作用的相關(guān)蛋白。mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)對脂肪細(xì)胞線粒體相關(guān)蛋白的基因表達(dá)、白色脂肪細(xì)胞棕色化有促進(jìn)的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

2.5 mGluR5調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸

相比于DMSO處理的細(xì)胞，mGluR5拮抗劑 (MPEP，SIB) 可提高3T3L1細(xì)胞氧耗率(圖5)。MPEP，SIB處理后可提高脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)氧耗量。加入oligo后OCR值代表質(zhì)子漏耗氧，MPEP，SIB 可促進(jìn)脂肪細(xì)胞解偶聯(lián)氧耗量。加入FCCP后OCR值為細(xì)胞最大呼吸。因此，mGluR5 拮抗劑 (MPEP，SIB)可促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞線粒體呼吸功能，增加基礎(chǔ)氧耗量，解偶聯(lián)氧耗量與最大呼吸氧耗能力。

圖2 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂滴形態(tài)Fig 2 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated lipid droplets morphology of adipocytes(×100)

*P<0.05 compared with DMSO group圖3 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調(diào)節(jié)棕色脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)Fig 3 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated the expression of brown adipocytes specifical genes

圖 4 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)基因的表達(dá)Fig 4 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated

2.6 mGluR5調(diào)節(jié)脂肪分解能力(lipolysis)

mGluR5拮抗劑 (MPEP, SIB)可顯著增加脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)脂解率(P<0.05)，而用毛喉素(fors-kolin，F(xiàn)SK)刺激細(xì)胞后各組脂肪分解能力較刺激前均明顯增加，但與DMSO對照組相比沒有明顯改變(圖6)。因此 mGluR5拮抗劑(MPEP, SIB)可促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)脂肪分解能力，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調(diào)節(jié)線粒體呼吸Fig 5 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated

*P<0.05 compared with DMSO group圖6 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調(diào)節(jié)脂肪分解能力Fig 6 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated

3 討論

代謝型谷氨酸受體5(mGluR5)可調(diào)節(jié)興奮性谷氨酸遞質(zhì)和突觸后信號，可作為多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物作用靶點， 在神經(jīng)生物領(lǐng)域受到極大關(guān)注[7]。既往文獻(xiàn)報道m(xù)GluR5 拮抗劑可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)食欲，從而調(diào)節(jié)小鼠體質(zhì)量[8]。有趣的是文獻(xiàn)中同時也指出當(dāng)人為控制小鼠進(jìn)食，予以相同飲食時，mGluR5-/-小鼠的體質(zhì)量仍明顯輕于對照組，顯示mGluR5可能通過中樞食欲調(diào)節(jié)以外的其他信號通路調(diào)控體質(zhì)量。同時文獻(xiàn)中指出使用mGluR5拮抗劑處理小鼠時，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體質(zhì)量減輕，脂肪減少，同時能量消耗增加[8]。顯示 mGluR5可能在外周通過脂肪組織調(diào)控體質(zhì)量。既往研究已證實mGluR5在外周也發(fā)揮一定作用[9]，但其是否在脂肪組織中表達(dá)及發(fā)揮作用尚不清楚。mGluR5 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用非常廣泛，微小劑量即有可能破壞神經(jīng)系統(tǒng)平衡，引起抑郁等其他相關(guān)副作用[10]。因此，mGluR5通過在外周作用于脂肪組織調(diào)控體質(zhì)量可避免藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

本研究證實了mGluR5 在不同類型脂肪組織中差異性表達(dá)。棕色脂肪細(xì)胞mGluR5 的表達(dá)明顯低于腹股溝白色脂肪(皮下脂肪組織)及附睪白色脂肪(內(nèi)臟脂肪組織)，尤其顯著低于附睪白色脂肪。內(nèi)臟脂肪組織對于代謝異常更有意義[11]。棕色脂肪組織的低表達(dá)提示抑制mGluR5可能有助于脂肪細(xì)胞特別是內(nèi)臟脂肪向棕色化轉(zhuǎn)變。mGluR5拮抗劑處理后，脂肪細(xì)胞脂滴體積減小，數(shù)量增多，更接近棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)[3]。mGluR5拮抗劑可在白色脂肪細(xì)胞中促進(jìn)UCP1、PRDM16和PGC1α的表達(dá)。UCP1是解偶聯(lián)蛋白，是棕色脂肪發(fā)揮產(chǎn)熱耗能作用的特異性蛋白；PRDM16和 PGC1α是棕色脂肪細(xì)胞發(fā)育與功能的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。mGluR5 拮抗劑可促進(jìn)3T3L1 細(xì)胞 UCP1 等棕色脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，并調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)基因表達(dá)，從基因水平上證明mGluR5拮抗劑可促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞棕色化。棕色脂肪細(xì)胞比白色脂肪更加活躍，擁有大量線粒體，有更強(qiáng)的細(xì)胞呼吸能力及脂肪分解能力[3]。mGluR5 拮抗劑可促進(jìn)細(xì)胞呼吸及脂肪分解能力，在功能層面上證明mGluR5調(diào)控白色脂肪細(xì)胞的代謝改變，促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞棕色化。mGluR5可能作為藥物作用靶點，成為減肥藥物應(yīng)用于臨床。