陳巍巍，單偉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展的快速增加，物質(zhì)的日漸豐富，人們生活節(jié)奏也前所未有的加快。因此，不同程度的焦慮等神經(jīng)或精神癥狀也日漸增多。報道顯示，10%～15% 的成年人符合失眠癥臨床標(biāo)準(zhǔn)[1]。另外，失眠癥造成的間接后果性損害(如工傷、病假等)明顯大于直接損害(如失眠癥治療所需費(fèi)用等)[2]。因此，安全有效的鎮(zhèn)靜催眠藥物一直是臨床和基礎(chǔ)研究者的研發(fā)熱點(diǎn)之一。我國傳統(tǒng)經(jīng)典藥物棗仁安神膠囊單獨(dú)應(yīng)用或者聯(lián)合其他藥物使用對失眠癥患者、冠心病伴焦慮抑郁患者的臨床效果較好[3-6]，但對該藥的相關(guān)機(jī)制研究尚少見?；诖?，本組資料棗仁安神膠囊對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用和機(jī)制進(jìn)行探討，為該藥的應(yīng)用和機(jī)制提供理論依據(jù)，以期為失眠癥治療提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

棗仁安神膠囊(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司批號131202)，陽性對照藥(康斯頓廣州萬康保健品有限公司，20180311；巴比妥鈉(EXP:20190221)、戊巴比妥鈉(EXP:20190311)，sigma公司。A1R和A2AR抗體，cy3標(biāo)記二抗。

1.2 動物

昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g。許可證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.3 儀器

石蠟切片機(jī)(德國萊卡LEICA-RM2135)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司FACS Calibur)、熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(以色列MF-ChemiBIS3.2)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，bx60日本)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)分4組：空白對照組、棗仁安神膠囊低、中、高劑量組(0.19、0.38、0.76 g/kg)，康斯頓陽性組(0.45 g/kg)，連續(xù)30 d，灌胃給藥，每10 g用藥0.2 mL。實(shí)驗(yàn)開始與結(jié)束，記錄并分析體重。給藥30 d后，取肝臟、腎臟，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅染色(HE)。

2.2 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

空白對照組給予同體積溶劑后，是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)，當(dāng)小鼠置于背臥位時，能立即翻正身位。如超過30～60 s不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間，記錄入睡動物數(shù)及睡眠時間。

2.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)[7]

正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定使動物100%入睡，但又不使睡眠時間過長的戊巴比妥鈉劑量，用此劑量正式試驗(yàn)。在末次灌胃15 min后，給各組動物按90 mg/kg(依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)ip戊巴比妥鈉(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失為睡眠指標(biāo)，記錄睡眠時間。

2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

確定戊巴比妥鈉閾下催眠劑量40 mg/kg，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大閾下劑量。用此劑量進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。在末次給藥15 min后，給各組動物按40 mg/kg(依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)ip戊巴比妥鈉(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失達(dá)1 min以上作為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄30 min內(nèi)各組入睡動物數(shù)和睡眠發(fā)生率。

2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期[8]

確定使動物100%入睡，但又不使睡眠時間過長的巴比妥鈉劑量230 mg/kg，用此劑量正式試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在末次灌胃15 min后，給各組動物按230 mg/kg ip巴比妥鈉(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失為指標(biāo)，觀察睡眠潛伏期。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測小鼠腦組織中A1R和A2AR

末次給藥30 min后，取空白對照組、棗仁安神膠囊高劑量組小鼠腦組織，一半用于流式細(xì)胞儀檢測，一半用于蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測。研磨為勻漿，用移液器反復(fù)吹散，過濾，離心，去除上清。按照說明書，按1∶100的比例稀釋A1R和A2AR抗體，加入腦組織，洗滌，加入二抗，再次洗滌。上樣流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Western Blot參考[9]，常規(guī)裂解、離心、變性、轉(zhuǎn)模、孵育，β-actin為內(nèi)參。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 形態(tài)學(xué)檢測和體重的結(jié)果

棗仁安神膠囊及對照組動物在給予棗仁安神膠囊60 min內(nèi)，均未發(fā)生直接睡眠現(xiàn)象。給藥期間小鼠腹瀉、自主活動、皮毛等方面未見異常，肝臟、腎臟病理切片與空白組比較無異常，見圖1。實(shí)驗(yàn)前，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，各組小鼠的體重比較，差異不顯著，即藥物對小鼠的體重增長無影響，見表1。

表1 棗仁安神膠囊對小鼠體重的影響

圖1 肝臟和腎臟組織病理圖(HE染色)

3.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

與空白對照組比較，棗仁安神膠囊高劑量組睡眠發(fā)生率明顯增加，差異顯著。棗仁安神膠囊低、中劑量組、陽性組延長睡眠時間，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明棗仁安神膠囊能延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間，見表2。

3.3 巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

與空白對照組比較，棗仁安神膠囊高劑量組睡眠潛伏期明顯減少。低、中劑量組降低睡眠潛伏期，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明棗仁安神膠囊能減少巴比妥鈉睡眠潛伏期，見表3。

3.4 小鼠腦組織中A1R和A2AR表達(dá)

流式和Western Blot檢測顯示：棗仁安神膠囊高劑量組與對照組比較，A1R和A2AR表達(dá)明顯增高，見圖2。

表2 棗仁安神膠囊對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠體重睡眠時間的影響

表3 棗仁安神膠囊對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

A：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖；B、C：Western Blot的方法檢測結(jié)果(*P < 0.05與空白對照組相比)

4 討 論

失眠癥指的是由于多種原因所引起的經(jīng)常性睡眠減少，或者睡而易醒，醒后無法再次入睡，或者這不容易入睡，睡眠時間縮短，甚至徹夜難眠的一種病證。棗仁安神膠囊由酸棗仁(炒)、丹參、五味子(醋炙)組成，功效重點(diǎn)在補(bǔ)陰、斂陰，即滋補(bǔ)腎水，收斂肝陰，調(diào)節(jié)肝腎功能，達(dá)到體內(nèi)陰陽平衡，養(yǎng)心安神的目的，可有效治療失眠癥。本研究首先考察了棗仁安神膠囊對實(shí)驗(yàn)小鼠體重的影響。結(jié)果提示，受試藥物對小鼠體重?zé)o影響，從體重增長角度和病理實(shí)驗(yàn)證實(shí)該藥物對生長情況沒有影響。給藥期間，實(shí)驗(yàn)動物腹瀉、自主活動、皮毛等方面未見異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明了中藥棗仁安神膠囊對生長情況及器官臟器安全性。目前，很多報道顯示棗仁安神膠囊對失眠癥患者臨床效果良好。本實(shí)驗(yàn)從入睡情況和睡眠時間上分別考察了棗仁安神對睡眠的影響，結(jié)果顯示棗仁安神膠囊具有改善睡眠的作用。與臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[3]167-168。本文采用陽性藥康斯頓牌改善睡眠膠囊作為對照，主要成分酸棗仁提取物、遠(yuǎn)志提取物、牡蠣粉、茯苓提取物、百合提取物、硬脂酸鎂；保健功能：改善睡眠；適宜人群：睡眠狀況不佳者。該藥物主要成分與我們受試藥物相似，都含有酸棗仁，與受試藥物都屬于中成藥，故選作陽性藥物。關(guān)于睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該陽性藥物在推薦劑量下對小鼠有作用趨勢，無顯著性差異?？赡艿脑?，我們推測可能由于實(shí)驗(yàn)中采用的陽性藥劑量對戊巴比妥鈉、巴比妥鈉干預(yù)下的睡眠作用影響不明顯。

臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對于棗仁安神的藥效學(xué)研究并不少見，但是對其作用機(jī)制研究尚不多見。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測腦內(nèi)蛋白的表達(dá)，對其改善睡眠的作用進(jìn)一步探討。腺苷是一種內(nèi)源性的促進(jìn)睡眠的物質(zhì)[10]。據(jù)報道，在長時間的覺醒過程中，大腦特定區(qū)域中腺苷酸的分泌增加，這對增加睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著非常重要的作用[11]。文獻(xiàn)報道顯示腺苷和穩(wěn)定的腺苷類似物證明可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物入睡[12]。腺苷在生理濃度，通過膜受體結(jié)合級聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的腺苷受體有四種亞型:A1R、A2AR、A2BR和A3R。其中，A1R和A2AR與睡眠調(diào)節(jié)相關(guān)[13]。近年來，對有關(guān)腺苷與鎮(zhèn)靜催眠關(guān)系以及與腺苷和腺苷受體相關(guān)的藥物研究日漸深入，研制腺苷受體相關(guān)鎮(zhèn)靜安眠藥物[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示棗仁安神膠囊高劑量組腦內(nèi)A1R和A2AR表達(dá)增加，提示棗仁安神膠囊可能通過提高A1R和A2AR而發(fā)揮作用。關(guān)于棗仁安神膠囊通過何種信號通路對腺苷受體發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過動物實(shí)驗(yàn)探討棗仁安神膠囊的催眠作用及可能機(jī)制。結(jié)果顯示，棗仁安神膠囊無論在增加睡眠時間還是縮短入睡時間方面均具有改善作用，并且可能與提高A1R和A2AR有關(guān)。