崔海悅，范思琪，李雨芳，劉影，劉濤

(錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

格列美脲(glimepiride，GM)是第三代磺酰脲類長效口服降血糖藥物，用于治療單純飲食和運(yùn)動(dòng)控制不能達(dá)到理想的降糖效果的2型糖尿病，該藥具有高效、長效、用藥量少、低血糖不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[1]。但其水中溶解度極差，藥物的溶出速率受到限制，因此,生物利用度低。據(jù)報(bào)道，在美國已上市TOP 200的藥品中大約 40%的藥物為水難溶性或者水不溶性[2-3]，因此，要使更多難溶性藥物，最大限度地發(fā)揮藥效，就要提高該類藥物的溶解度和生物利用度。這是新藥創(chuàng)制和現(xiàn)有藥物功效改善領(lǐng)域需要解決的關(guān)鍵問題。無機(jī)納米多孔材料為解決這一問題提供了一種新的手段。介孔碳是納米介孔結(jié)構(gòu)材料的一種[4-5]，它的孔道具有一定的特點(diǎn)如：排列有序、大小均勻、比表面積大、孔徑可調(diào)節(jié)等[6-8]。有序孔道為藥物提供貯存的場所，并限制其結(jié)晶，由此表面積增大，為增溶難溶性藥物提供了新途徑。本文以MCN為載體通過吸附法制備格列美脲介孔碳納米粒改善其水溶性，同時(shí)考察其對2型糖尿病大鼠的降糖效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

格列美脲(上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號：Y03J7C15616)；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物Pluronic F127(上海阿拉丁生化科技有限公司，批號：H1A2527)；人Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞系(南京凱基生物)；MTT(北京鼎國生物技術(shù)有限公司，批號：83220101100)；羅丹明鬼筆環(huán)肽(AAT Bioquest，批號：1770273)；Hoechst 33342(sigma公司，批號：117m4047v)；其他試劑均為分析純，市售。反應(yīng)釜(威海興盛化工機(jī)械有限公司，型號:200 mL)。

1.2 方法

1.2.1 MCN的制備

1.2 g苯酚、4.2 mL甲醛水溶液在攪拌下加入到30 mL 0.1 M的氫氧化鈉水溶液中，在70 ℃下攪拌30 min，加入30 mL含有1.92 g F127的水溶液，攪拌2 h后加入100 mL水，反應(yīng)18 h后，用112 mL水稀釋，然后將體系加入到反應(yīng)釜中，130 ℃反應(yīng)24 h，得到的產(chǎn)物經(jīng)水洗干燥，在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行碳化(25～350 ℃ 1 h、350～550 ℃ 2 h、550～750 ℃ 2 h、 750～750 ℃ 1 h)，得到的產(chǎn)物即MCN。

1.2.2 載藥

采用吸附法進(jìn)行載藥，取格列美脲1 g溶于30 mL二氯甲烷中，另取1 g MCN加入到含藥二氯甲烷中，磁力攪拌6 h，吸附完全后，離心，棄上清收集沉淀，離心濃縮去除溶劑，將合成得到的藥物粉末在45 ℃減壓干燥12 h，即得MCN包載格列美脲的載藥樣品(GM- MCN)。

1.2.3 載藥量測定

1.2.3.1 色譜條件 色譜條件為：色譜柱：Agilent TC C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈：0.1%磷酸二氫鈉水溶液(50∶50)；檢測波長228 nm；流速1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.3.2 對照品溶液的配制 精密稱取格列美脲對照品0.6 mg，放置于1 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后加乙腈到相應(yīng)的刻度，搖勻，作為對照品溶液，備用。

1.2.3.3 供試品溶液的配制 在1 mL容量瓶中精密稱取GM-MCN 5 mg，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液，備用。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密稱取格列美脲對照品適量，加乙腈配制成濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的系列溶液，按1.2.4.1色譜條件分別進(jìn)樣分析。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.5 精密度考察 精密吸取對照品溶液10 μL，按1.2.4.1色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣次數(shù)為6次，測定格列美脲的峰面積，同時(shí)計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.3.6 載藥量測定 對制備的3批樣品經(jīng)HPLC進(jìn)行載藥量測定，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，每次10 μL，測定格列美脲峰面積，同時(shí)計(jì)算載藥量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物含量。

1.2.4 透射電鏡(TEM)表征

透射電鏡觀察MCN形態(tài)及介孔結(jié)構(gòu)，檢測電壓為200 kV。

1.2.5 差示掃描量熱法(DSC)表征

格列美脲在MCN載體載藥前后的狀態(tài)變化用差示掃描量熱儀來測定。取適量的樣品放置在儀器中調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?50 mL/min、設(shè)定掃描速度為10 ℃/min、掃描范圍50～350 ℃。

1.2.6 MCN 載體對Caco-2細(xì)胞的毒性研究

人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為DMEM，胎牛血清濃度為10%，溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化后接種在96孔板上，每孔1 × 106個(gè)，在上述培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液吸出，取不同濃度的MCN 溶液(濃度分別為5、10、50、100、250、500 μg/mL)200 μL分別加入到相應(yīng)的孔中，每個(gè)濃度重復(fù)6次，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出孔中的液體，每孔加DMSO 200 μL，于搖床上震搖10 min。于酶標(biāo)儀(波長492 nm)檢測各孔的光密度值(OD值)。按對照組細(xì)胞存活率為100% 計(jì)算相應(yīng)指標(biāo)。細(xì)胞存活率% =(OD測定 /OD對照)× 100%。

1.2.7 Caco-細(xì)胞MCN對攝取研究

將處于對數(shù)增長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞接種在共聚焦板中，細(xì)胞數(shù)濃度在 1 ×105個(gè)，在37 ℃，5% CO2的孵箱培養(yǎng)24 h后，加入的50 μg/mL含有 FITC 標(biāo)記的 MCN，其制備方法為500 mg MCN粉末置于250 mL 錐形瓶中，在100 ℃下油浴反應(yīng) 30 min，在250 mL的三頸燒瓶中放入干燥后的MCN粉末，加無水乙醇入50 mL，3-氨丙基三乙氧基硅烷2 mL，整個(gè)系統(tǒng)通氮?dú)猓?7 ℃加熱攪拌，回流10 h，反應(yīng)后，濾過離心，取沉淀用無水乙醇洗滌3次，減壓干燥，收集粉末為氨基化后的MCN。稱取1 mg FITC放置于西林瓶中，加入1 mL 的無水乙醇使其溶解，再向西林瓶中加入氨基化后的MCN粉末100 mg，靜置吸附3 h，離心收集沉淀，得到含有 FITC 標(biāo)記的 MCN。分別培養(yǎng)1、2 、3 h后，分別吸出培養(yǎng)液，PBS洗3次，4%多聚甲醛溶液室溫固定10 min。PBS洗3次，用0.1%的Triton X-100 4 ℃孵育10 min。PBS洗3次，1%白蛋白封閉液37 ℃封閉30 min后染色。1 μg/mLHoechst 33342對細(xì)胞核進(jìn)行染色10 min，1 μg/mL羅丹明鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞骨架染色30 min。染色結(jié)束PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察載藥體系的細(xì)胞攝取過程。

1.2.8 GM-MCN降糖效果研究

30只雄性SD大鼠正常喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)抽取6只為正常對照組，其余動(dòng)物制備二型糖尿病模型。普通大鼠飼料喂養(yǎng)正常對照組大鼠，其余大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 w，按照25 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)2次，正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)。注射72 h后剪尾取血，測定血糖，連續(xù)3 d，血糖穩(wěn)定后，血糖>11.1 mmol/L的大鼠作為造模成功大鼠。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、MG-MCN組和上市藥物組，每組6只，給藥劑量0.3 mg/kg，灌胃給藥，正常對照組和模型組分別灌服生理鹽水，連續(xù)給藥1 w，分別在0、3、7 d剪尾測空腹血糖，觀察血糖變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 SPSS 19.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本之間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察載體結(jié)構(gòu)

透射電鏡結(jié)果顯示MCN呈規(guī)則的球形，清晰可見其納米級介孔結(jié)構(gòu)，粒徑約為100 nm，見圖1。

2.2 差示掃描量熱法(DSC)表征結(jié)果

使用差示掃描量熱法(DSC)對載體進(jìn)行表征結(jié)果顯示MCN 沒有相轉(zhuǎn)變溫度，為無定形態(tài)。格列美脲(GM)的熔點(diǎn)為212.2 ℃，在210 ℃左右出現(xiàn)吸收峰；MCN沒有出現(xiàn)吸收峰；PM為藥物與載體物理混合物，出現(xiàn)的吸收峰為藥物與載體共同作用產(chǎn)生的；GM-MCN吸收峰消失，說明藥物的晶型狀態(tài)改變，在 MCN 孔隙中的藥物存在形式為以無定型狀態(tài)，見圖2。

圖1 MCN透射電鏡圖

圖2 GM-MCN、PM、MCN和GM的 DSC曲線

2.3 載藥量測定結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以藥物濃度為橫坐標(biāo) X，峰面積為縱坐標(biāo) Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y= 293.8X+22946(r=0.9996)。結(jié)果表明格列美脲的含量在0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示保留時(shí)間穩(wěn)定，峰面積的RSD=0.53%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 載藥量測定結(jié)果

經(jīng)HPLC法對3批樣品按上述色譜條件進(jìn)行載藥量測定，最終載藥量結(jié)果為(19.3±0.35)%。

2.4 MCN 對Caco-2細(xì)胞的毒性研究

通過MTT實(shí)驗(yàn)考察MCN對Caco-2細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示當(dāng)載體濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)細(xì)胞的存活率為89%，表明MCN 基本無細(xì)胞毒性，適合作為載體材料，見圖3。

2.5 Caco-2細(xì)胞對MCN攝取實(shí)驗(yàn)

通過激光共聚焦顯微鏡觀察人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞對MCN攝取情況，結(jié)果顯示綠色熒光為FITC 標(biāo)記的 MCN，Hoechst 33342染料將細(xì)胞核染成藍(lán)色熒光。羅丹明鬼筆環(huán)肽染料將細(xì)胞質(zhì)染成紅色熒光，當(dāng)藥物被Caco-2細(xì)胞攝取后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞團(tuán)周圍形成綠色熒光，Caco-2細(xì)胞對MCN攝取具有時(shí)間依賴性，3 h的細(xì)胞攝取量明顯高于1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 MCN作為載體能夠被細(xì)胞吞噬，從而促進(jìn)藥物的吸收，見圖4。

圖3 MCN對人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞存活率的影響

圖4 人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞對MCN攝取情況

2.6 GM-MCN降糖效果研究

本研究通過喂養(yǎng)高脂高糖飲食加小劑量STZ來模擬2型糖尿病模型，研究結(jié)果顯示2型糖尿病模型組大鼠明顯出現(xiàn)三多一少的癥狀，空腹血糖升高，給藥3 d和7 d后，GM-MCN組和上市藥組大鼠的血糖與模型組比較明顯降低P<0.05，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

*與正常組比較(P<0.05);#與糖尿病組比較(P<0.05)

3 討 論

介孔材料是一種特殊的納米材料，由于孔徑不同可分為3類：微孔材料為孔徑小于2 nm，介孔材料為20～50 nm，大孔材料為孔徑大于50 nm，孔徑與比表面積成反比[9]。介孔材料的制備方法常用的有模板法、活化法、溶膠-凝膠法，其中模板法分為硬模板法和軟模板法，本文采用的是軟模板法制備MCN。在制備樣品的過程中模板劑的類型和結(jié)構(gòu)對介孔材料的結(jié)構(gòu)和性能有著直接的影響，本文在制備樣品時(shí)選取F127 和F123兩種三嵌段共聚物為模板劑，制備的樣品顯示F123制備的樣品結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，沒有形成有序的孔道，而F127為模板制備的樣品穩(wěn)定性好，存在有序的孔道，因此本文選取F127為模板劑制備MCN。MCN是一種很有前途的藥物載體，它具有光滑的邊緣對細(xì)胞的損傷小，具有豐富的空隙結(jié)構(gòu)，其空間限制效能能夠使藥物的粒子大小和結(jié)晶度降低，增加藥物的分散性，提高藥物的溶出速率，促進(jìn)藥物的吸收。

本研究通過透射電鏡觀察MCN的結(jié)構(gòu)，對其內(nèi)部構(gòu)成進(jìn)行直觀說明。通過差示掃描量熱法來研究藥物的存在狀態(tài)，從結(jié)果中我們看出GM和PM在215 ℃出現(xiàn)一個(gè)吸熱的峰，而MCN和GM-MCN在圖中是一條直線說明其沒有融化和吸熱反應(yīng)，說明格列美脲是以無定型狀態(tài)存在MCN中，進(jìn)而改變藥物的晶型提高藥物的溶解性。

小腸是人體吸收的主要場所，在一定培養(yǎng)條件下人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞能夠產(chǎn)生與小腸上皮細(xì)胞類似的形態(tài)學(xué)，表達(dá)相同標(biāo)志酶，具有相同的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)及滲透特征，被用于藥物經(jīng)小腸上皮細(xì)胞吸收機(jī)制的研究[10]。本研究制備MCN載體，采用 Caco-2 細(xì)胞模型，研究MCN被腸上皮細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運(yùn)的特性。研究結(jié)果顯示MCN經(jīng)過內(nèi)吞的方式被 Caco-2 細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并且隨著時(shí)間的延長攝取量逐漸增加，說明MCN能夠被細(xì)胞吞噬，使得細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加，從而提高小腸吸收及提高藥物口服吸收的生物利用度。

2型糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病。本文制備的載藥體系能夠有效地降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，同時(shí)提高格列美脲的生物利用率，減少格列美脲的劑量和和頻率，從而達(dá)到穩(wěn)定的血糖水平，降低糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，改善病人的依從性的作用。