袁愛華 ，駱瑜 ，王維亞 ，林志超

（1.南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330096；2.南昌市食品安全檢測與控制重點實驗室, 江西 南昌 330096）

堅果及籽類制品包含品種多達(dá)20 多種，其口味獨特，營養(yǎng)價值豐富，含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、微量元素、膳食纖維和多種不飽和脂肪酸。該類產(chǎn)品具有抗氧化、軟化血管、抑制肥胖和降低糖尿病發(fā)病率等作用[1,2]。隨著人們生活條件的改善和保健意識的提升,對堅果與籽類制品的需求量日見增長。但堅果與籽類制品在生產(chǎn)、儲存及運輸時極易受到霉菌的污染,食品的深加工和網(wǎng)購的流行，更讓產(chǎn)品質(zhì)量難以保證。歐盟食品和飼料快速警報系統(tǒng)（RASFF）的報告數(shù)據(jù)顯示，真菌毒素是堅果和籽類食品中報告頻率最高的有害物質(zhì)[3,4]。真菌毒素是霉菌產(chǎn)生的有害次生代謝產(chǎn)物[5]，食源性霉菌已成為食品安全風(fēng)險的重要來源之一。霉菌的檢測主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、生化檢測法、代謝學(xué)檢測法、流式細(xì)胞技術(shù)法、實時光電微生物檢測法及分子生物學(xué)檢測法等[6]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為國標(biāo)金標(biāo)準(zhǔn)，存在檢測時間長、操作復(fù)雜及工作量大的缺點。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對監(jiān)管時限要求的提高, 快速高效的檢測方法逐漸受到廣泛關(guān)注。PCR 檢測技術(shù)以其快速、簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點在國際上得到了廣泛的認(rèn)可[7]，被譽為現(xiàn)代快速方法的金標(biāo)準(zhǔn)。在霉菌檢測方面，預(yù)計PCR 檢測比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法快4～6d。由于霉菌PCR 檢測技術(shù)起步較晚，加之霉菌生理和形態(tài)的多樣化和復(fù)雜性，及食品成分的基質(zhì)效應(yīng)也可能影響菌體生長和PCR 擴增[8],致使霉菌PCR 檢測技術(shù)應(yīng)用并不廣泛。黑曲霉菌是增菌培養(yǎng)基的霉菌質(zhì)控菌珠,黃曲霉菌和青霉菌是農(nóng)產(chǎn)品貯存過程中出現(xiàn)的主要致腐菌[9-12]。為提高堅果及籽類制品中霉菌的檢測時效,本研究以黑曲霉、青霉菌、黃曲霉菌為實驗菌珠,通過改良前增菌培養(yǎng)，優(yōu)化擴增條件，建立適用于堅果及籽類制品的霉菌PCR 檢測技術(shù), 同時對本市抽樣的檢品進(jìn)行檢測, 并與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法進(jìn)行對比研究，確認(rèn)方法學(xué)的適用性和有效性，實現(xiàn)對堅果及籽類制品中霉菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 黑曲霉菌珠 CMCC（F）98003（定量1000～2000 CFU/顆,購自北京三藥科技開發(fā)公司），黃曲霉菌、青霉菌為本實驗室保存；花生仁、葵花子、瓜子、核桃、花生等為超市自購；68 批檢品為2019 年抽樣樣品。

1.2 儀器與試劑 西班牙BioII-Advance4 生物安全柜、上海一恒THZ－100 恒溫培養(yǎng)搖床、HIRYAM AHVA-85 高壓蒸汽滅菌鍋、 尼康XS212 顯微鏡、杜邦BAX SystemQ7 全自動病原微生物檢測系統(tǒng)、法國Interscience BagMixer400s 均質(zhì)器、 北京六一生物科技DYY-6C 型電泳儀、 上海勤翔科學(xué)儀器1880 凝膠成像系統(tǒng)。酪蛋白葡萄糖肉湯、馬鈴薯液體培養(yǎng)基（含氯霉素）、察氏液體培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、麥芽浸粉、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基( PDA)均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，孟加拉紅購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，馬鈴薯汁（自制，取去皮馬鈴薯200 g 切成小塊，加水1000ml，煮沸 20min，紗布過濾，備用）。杜邦霉菌檢測試劑盒購自Hygiena LLC。氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵，均為化學(xué)純或分析純。

1.3 改良培養(yǎng)基的配置 改良酪蛋白葡萄糖肉湯配方：酪蛋白葡萄糖肉湯加馬鈴薯（200g/1000ml）（簡稱酪改），改良麥芽汁培養(yǎng)基配方：麥芽汁培養(yǎng)基加氯化鈉5g/1000ml（簡稱麥改），改良馬鈴薯液體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯液體培養(yǎng)基加磷酸氫二鉀1 g/1000ml、 硫酸鎂 0.5g/1000ml、 氯化鉀 0.5g/1000 ml、硫酸亞鐵 0.01g/1000ml（簡稱馬改），改良察氏液體培養(yǎng)基配方：察氏液體培養(yǎng)基加馬鈴薯（200g/1000ml）（簡稱察改），以上培養(yǎng)基高壓滅菌后按每管1ml 分裝于帶分裂珠的分裂管， 所有培養(yǎng)基均為新鮮配制。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液的制備 將定量黑曲霉菌株用配套菌株復(fù)溶液活化后以0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，用移液器充分吹打使孢子呈均勻分散狀態(tài),采用血球計數(shù)板對孢子計數(shù)后進(jìn)行梯度稀釋,使孢子懸液濃度約為 100 CFU/ml、200 CFU/ml 備用。黃曲霉菌、青霉菌以0.9%無菌氯化鈉溶液制備后與黑曲霉菌混勻，同方法進(jìn)行梯度稀釋，使混合孢子懸液濃度約為 100 CFU/ml、200 CFU/ml 備用。

1.4.2 前增菌的優(yōu)化 對5 種霉菌常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行改良，以相互缺少成分為變量，分別按組合排列方式添加至原培養(yǎng)基中, 得到改良培養(yǎng)基共51種, 通過對30 h 內(nèi)黑曲霉菌肉眼可見菌絲球的培養(yǎng)基進(jìn)行36 h 干質(zhì)量對比和形態(tài)分析, 篩選出適合霉菌快速增菌的優(yōu)勢改良培養(yǎng)基：酪改、麥改、察改、馬改[13]，并對此4 種優(yōu)勢改良培養(yǎng)基進(jìn)行堅果及籽類制品中霉菌的PCR 檢測。

1.4.3 PCR 體系的優(yōu)化 通過預(yù)實驗觀察食品基質(zhì)加入培養(yǎng)基的狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，花生仁、核桃仁等脂質(zhì)含量高和出漿高的堅果與籽類易使培養(yǎng)基渾濁，易造成檢測結(jié)果假陰性，為減少基質(zhì)對DNA 的提取和PCR 擴增的影響,樣品均質(zhì)后應(yīng)靜止5min 后取上清液作增菌培養(yǎng)。DNA 提取液和PCR 引物及反應(yīng)體系均使用杜邦BAX system 霉菌試劑盒組分及方案。確定 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 2min，1個循環(huán)；保持退火溫度56 ℃ 45S，72 ℃延伸120S，共擴增38 個循環(huán),可減少非特異性產(chǎn)物的形成，用杜邦BAX SystemQ7 擴增并讀取結(jié)果后，將擴增產(chǎn)物在1 .50 %瓊脂糖凝膠電泳上分離驗證。

1.4.4 敏感性實驗 通過預(yù)實驗后, 對人工污染樣品檢測限度進(jìn)行確認(rèn)。取黑曲霉菌及混合備用孢子懸液按10 倍比例分別對經(jīng)檢測無菌的花生仁進(jìn)行人工污染,使各霉菌懸液在花生仁中的含量分別約為10 CFU/g、20 CFU/g。黑曲霉菌和混合霉菌污染的花生仁各取10g 放置到90ml 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋, 均質(zhì)器拍打30 S 制成均勻的懸混液備檢。各取 200μl 懸混液至 1ml 酪改、 馬改、麥改、察改分裂管中增菌,28 ℃、160r/min 恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)26h 增菌。增菌液按杜邦BAX 霉菌試劑盒說明進(jìn)行DNA 的核酸提取,取50μL 裂解物按優(yōu)化后的擴增條件進(jìn)行擴增讀取結(jié)果，建立PCR 方法。同時,對以上各樣品按國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.15-2016[14]霉菌的培養(yǎng)方法各取1ml 至平皿(n=2)進(jìn)行驗證。

1.4.5 樣品前處理的影響 因GB19300-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)堅果與籽類食品》[15]中僅對過氧化值和酸價的檢測明確了樣品前處理方式,對霉菌的檢測未明確樣品前處理方式?？紤]嗑食和剝食的食用方式與外殼的接觸程度,及堅果類食品的外殼前處理方式對霉菌檢測結(jié)果的影響,分別選取可嗑食的葵花子、瓜子各1 份和剝食的核桃、花生各2 份置80%濕度環(huán)境，暴露受潮20 d，對以上樣品進(jìn)行去殼和不去殼處理后， 常規(guī)取樣均質(zhì)器拍擊后用已建立的PCR 和傳統(tǒng)培養(yǎng)法（n=2)進(jìn)行檢測與驗證。

1.4.6 實際樣品檢測 對68 份日常監(jiān)督抽樣樣品進(jìn)行PCR 檢測與傳統(tǒng)培養(yǎng)法驗證。各取10g 放置到90ml0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋,均質(zhì)器拍打30S制成均勻的懸混液備檢。各取200μl 備檢懸混液,放置到1ml 酪改、馬改、察改分裂管中增菌，28℃、160r/min 恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)26h 后按PCR 法進(jìn)行檢測。同時,對以上各樣品按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15～2016[14]霉菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行檢驗驗證。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感性實驗 由圖1 可知,杜邦BAX SystemQ7檢測結(jié)果除空白陰性外，麥2 結(jié)果也是陰性，說明麥2 未檢出；從電泳圖可以發(fā)現(xiàn)所有內(nèi)標(biāo)陽性和檢測結(jié)果條帶清晰，未見其它非特異性擴增產(chǎn)物，檢測項目除麥2 和空白陰性外, 其它檢測結(jié)果均陽性,與杜邦BAX SystemQ7 檢測結(jié)果一致。對以上污染樣品用孟加拉紅培養(yǎng)5d 計數(shù)，黑曲霉菌液分別為 9 CFU/g、20 CFU/g，混合菌液分別為 10 CFU/g、18 CFU/g。由以上結(jié)果可知，除在麥芽汁改良培養(yǎng)基26h 增菌，檢測結(jié)果不穩(wěn)定外，酪改、馬改、察改對于黑曲霉菌及混合霉菌污染樣的檢測限度均能達(dá)到10 CFU/g,檢測限度優(yōu)于試劑盒原非合并樣品檢測法；和杜邦BAXsystem 中針對酸奶、玉米粉和嬰兒配方奶粉中酵母菌和霉菌的檢測時間對比，檢測時效縮短18h。考慮改良麥芽汁培養(yǎng)基在10 CFU/g 檢測限度時不穩(wěn)定，故只用酪改、馬改、察改作前增菌培養(yǎng)基進(jìn)行實際樣品驗證。

圖1 人工污染樣品敏感性實驗結(jié)果

2.2 樣品前處理的影響 霉菌菌絲雖有可穿透食品的物理三維空間性質(zhì)，但由檢測結(jié)果可知，核桃的霉菌PCR 檢測結(jié)果, 未去殼的核桃四種增菌液中檢測均陰性,而去殼的核桃四種增菌液中檢測結(jié)果均為陽性,對照培養(yǎng)法的結(jié)果可見未去殼核桃中霉菌結(jié)果分別為7 CFU/g、5 CFU/g，去殼核桃中霉菌結(jié)果分別為11 CFU/g、13 CFU/g。未去殼的花生和去殼的花生四種增菌液中PCR 檢測結(jié)果均為陽性,對照培養(yǎng)法的結(jié)果可見未去殼花生中霉菌結(jié)果分別為22 CFU/g、35 CFU/g，去殼花生中霉菌結(jié)果為 29 CFU/g、39 CFU/g。未去殼核桃、花生與去殼核桃、花生培養(yǎng)法結(jié)果均有顯著性差異，說明去殼后檢測結(jié)果更具代表性。這與花生和核桃類堅果易從可食部分滋生霉菌有關(guān),也與此類堅果外殼厚重而營養(yǎng)缺乏,霉菌滋生速度較慢但占取樣比重較大,而造成去殼和未去殼前處理方式對檢測結(jié)果影響較大。嗑食類的未去殼和去殼的葵花籽和瓜子四種增菌液中霉菌PCR 檢測均陰性, 對照培養(yǎng)法的結(jié)果可見葵花籽未去殼的結(jié)果1 CFU/g, 去殼后結(jié)果為＜1 CFU/g,未去殼和去殼的瓜子結(jié)果均為＜1 CFU/g，結(jié)果無顯著性差異。葵花籽和瓜子等籽類主要食用方式為嗑食，易食用到外殼污染菌，而剝食類與外殼相對接觸少,因此建議堅果及籽類制品中對微生物的檢測也應(yīng)該明確剝食類帶殼堅果應(yīng)剝?nèi)ネ鈿?，再取樣檢測。

2.3 實際樣品檢測 檢測結(jié)果表明，PCR 檢出5 份,檢出率為7.35%；培養(yǎng)法檢出8 份,檢出率為11.76%,共有3 批結(jié)果低于10 CFU/g,所以PCR 未檢出，按培養(yǎng)法可判定1 例不合格, 不合格率為1.47%。說明PCR 實驗的敏感性和特異性符合方法學(xué)預(yù)期，可作為快速檢測方法。

3 討論

由于霉菌孢子可以在空氣中長時間存活，并可通過空氣傳播給其他物質(zhì)，因此它們無處不在。霉菌污染產(chǎn)生的真菌毒素給人們的生活和健康帶來了極大的危害,其污染造成的損失一直是人們關(guān)注的焦點。近年來，世界上許多國家都制定了各種食品中霉菌的限量標(biāo)準(zhǔn)，同時，為加強對霉菌檢測技術(shù)的研究, 不斷提出改進(jìn)檢測技術(shù)的新思路。PCR 技術(shù)是對特定DNA 片段的擴增，在食源性微生物檢測中起著重要作用。本實驗通過改良前增菌時間和優(yōu)化擴增條件,研究堅果及籽類制品的基質(zhì)效應(yīng)對霉菌PCR 檢測的影響, 優(yōu)化建立適用于堅果及籽類制品的PCR 檢測方法。該檢測方案較杜邦BAXsystem 中針對酸奶、 玉米粉和嬰兒配方奶粉中酵母菌和霉菌的檢測方案時間縮短18h，檢測限可達(dá)10 CFU/g。經(jīng)驗證，敏感性和特異性滿足堅果及籽類制品中霉菌限量檢測要求。因PCR 檢測不能判斷病原菌的死活狀態(tài)，且無法定量，不能直接舉證病原菌的感染力,因而不能作為公共衛(wèi)生突發(fā)事件的病原學(xué)診斷依據(jù)和食品檢測限量標(biāo)準(zhǔn)的判定依據(jù), 故有待對實時定量PCR 檢測方法作進(jìn)一步研究。鑒于上述情況，建議在實際工作中和公共安全應(yīng)急檢驗及對堅果及籽類制品原材料大批量篩選時, 將PCR 法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合起來使用。根據(jù)PCR 最低檢測限可以篩出批量檢品中霉菌含量可能存在不合格的批次,對疑似不合格樣品進(jìn)行培養(yǎng)確定，從而達(dá)到快速精準(zhǔn)的檢測目的。

堅果及籽類制品在采摘、晾曬干燥等處理過程及保藏運輸過程中都可能受到霉菌的侵染[16]。散裝、非品牌、流通市場堅果不合格率不容樂觀[17,18]，與本實驗室近年監(jiān)督抽檢結(jié)果一致。一些不法商販為了盈利不惜違法以霉變原料經(jīng)處理后加工銷售，經(jīng)處理后的堅果及籽類制品外表無眼觀變化，但果肉可能霉菌量很高或變質(zhì)。為反映檢測結(jié)果的客觀真實性，建議對剝食類帶殼堅果剝?nèi)ネ鈿ぃ偃訖z測。