祁彥萍，楊瑞，楊建敏

（鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 南陽473000）

抗苗勒管激素（AMH）是轉(zhuǎn)化生長因子β 超家族中的一員,是由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的苗勒管抑制物質(zhì)。其血清水平高低可代表不同的卵巢儲(chǔ)備功[1]。有研究報(bào)道[2]多囊卵巢綜合癥（PCOS）患者血清AMH 水平顯著升高,充分說明,AMH 表達(dá)水平在卵巢儲(chǔ)備功能不同患者體內(nèi)存在差異。由此提醒研究者AMH 基因多態(tài)性與PCOS 發(fā)病機(jī)制具有一定的聯(lián)系[3]。本研究通過檢測PCOS 患者組與排卵正常的對(duì)照組 GT 基因型、BMI、PRL、P、T、FSH、E2及上述指標(biāo)與PCOS 的相關(guān)性差異,并同時(shí)研究A MH 基因多態(tài)性與患者體質(zhì)重指數(shù)（BMI）、GT 基因型、BMI、PRL、P、T、FSH、E2 進(jìn)行比較,以探討 AMH基因多態(tài)性與PCOS 患者代謝及激素紊亂之間的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2015 年 5 月-2017 年 5月確診的 PCOS 患者 100 例（PCOS 組）、正常排卵婦女 100 例（對(duì)照組）。PCOS 組，年齡 24～38 歲，平均 29.1±3.5 歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）24.2±2.3kg/m2。對(duì)照組,年齡 22～38 歲,平均 28.7±3.1 歲,BMI 21.8±1.8 kg/m2。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)[4]⑴患者年齡 19～38 歲；⑵PCOS組患者嚴(yán)格按照2003 年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)選取：①稀發(fā)排卵或無排卵；②高雄激素臨床表現(xiàn)和(或)高雄激素血癥；③一側(cè)或雙側(cè)卵巢多囊樣改變,上述3 條中符合2 條；⑶對(duì)照組婦女為正常排卵的健康自愿者；⑷本研究實(shí)施前與患者簽署保密協(xié)議、知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴伴有嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾??；⑵感染性疾病；⑶腫瘤疾病；⑷合并其他類型疾病。

1.3 E2、PRL、FSH、P、T 檢測方法 抽取患者月經(jīng)第3 天的空腹靜脈血進(jìn)行血清雌激素（E2）、催乳素（PRL）、卵泡雌激素（FSH）、孕酮（P）、睪酮（T）測定，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，所需要的試劑盒購自瑞士羅氏公司。

1.4 PCR 方法 ⑴總DNA 的提?。翰捎迷噭┖刑崛NA 方法,并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行(試劑盒由天根生化科技有限公司提供)；⑵AMH 目的基因序列PCR 擴(kuò)增：PCR 反應(yīng)總體積 25ul，AMHF 引物序列如下：上游5 一CCTI'CCACTCGGCTCGGCTCACTTA-3’，下游 TCCTCCAGGTGTAGGACCAC-5’，擴(kuò)增片段長度430bp AMH 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性 2 分鐘，94℃變性 3O 秒，55℃退火 30 秒，72℃延伸30 秒,從變性至延伸共3O 個(gè)熱循環(huán)后，再72℃延伸，12℃保存。反應(yīng)完成后，取5ul 上樣于2%瓊脂糖凝膠孔電泳35～35min 后,在紫外透射／凝膠成像儀上觀察PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。⑶PCR 產(chǎn)物純化：嚴(yán)格按照Milli.pore 公司96 純化板操作流程操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS16.0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic 回歸分析法；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的AMH 基因型、 等位基因頻率比較PCOS 組的GT 基因型45.00%，顯著的高于對(duì)照組的 25.00%（P＜0.05），PCOS 組的等位基因 T、G 頻率與對(duì)照組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)；見表1。

2.2 兩組的年齡、BMI、 性激素水平比較 PCOS 組和對(duì)照組的年齡、E2 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PCOS 組的 BMI、PRL、P、T 的水平顯著的高于對(duì)照組（P＜0.05），PCOS 組的 FSH 水平顯著的低于對(duì)照組（P＜0.05）；見表 2。

2.3 多因素分析結(jié)果 Logistic 回歸分析結(jié)果顯示：PRL、P、T 的水平、AMH 基因中 GT 基因型增高、FSH 水平降低是并發(fā)PCOS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (P＜0.05)；見表 3。

3 討論

PCOS 是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌及代謝性疾病，增加肥胖癥、動(dòng)脈硬化、心血管疾病及妊娠期糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。有研究表明[6]在 PCOS 患者中，約 30%妊娠期糖尿病患者產(chǎn)后多發(fā)展為2 型糖尿病。同時(shí)，PCOS 引起胰島素抵抗會(huì)引發(fā)一系列高胰島素血癥所伴隨的臨床癥狀如高雄激素血癥、代謝紊亂、生殖紊亂、多毛、痤瘡等。研究者認(rèn)為[7]胰島素抵抗是PCOS 的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)。近年來有學(xué)者研究PCOS 基因水平的發(fā)病機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)PCOS 的發(fā)病與AMH 基因多態(tài)性有關(guān)。AMH 是一種糖蛋白二聚體由二硫鍵連接形成[8]。AMH 需要與受體結(jié)合進(jìn)行相應(yīng)的信息傳遞,實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)。有I、II、III 三種受體，其中起主要作用的是AMHII 受體，其大部分由顆粒細(xì)胞表達(dá)，少量由卵泡膜細(xì)胞表達(dá)。通過連接AMHII 受體和AMH 實(shí)現(xiàn)AMH 的信息傳遞過程，具有控制卵泡生長和發(fā)育的功能，主要通過抑制卵泡細(xì)胞的起始和循環(huán)募集實(shí)現(xiàn)的[9]。由于相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[10]在IVF-ET 過程中，AMH 的表達(dá)不受促性腺激素作用的影響,能較獨(dú)立反應(yīng)卵巢儲(chǔ)蓄功能，排除其他因素的影響。

近年來，很多學(xué)者開始從基因水平研究PCOS的發(fā)病機(jī)制。周偉偉等研究發(fā)現(xiàn)[11]AMH 基因多態(tài)性與PCOS 發(fā)病機(jī)制相關(guān)，有研究通過給予外源性的AMH 發(fā)現(xiàn)，芳香酶mRNA 水平顯著降低，可進(jìn)一步抑制孕酮、睪酮的合成，下調(diào)LH 水平，最終抑制卵泡的形成過程，以此參與PCOS 的發(fā)生發(fā)展過程。其對(duì)PCOS 患者AMH、AMHII 受體的基因型多樣性與PCOS 發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)了學(xué)者認(rèn)為AMH 基因多態(tài)性與PCOS 發(fā)病相關(guān)性的觀點(diǎn)，且研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCOS 組的GT 基因型45.00%顯著的高于對(duì)照組的 25.00%（P＜0.05）,PC OS 組的等位基因T、G 頻率與對(duì)照組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；這與孫娜等學(xué)者報(bào)道研究結(jié)果一致[12]，其中 G/T 表型的患者中 BMI、LH、T水平顯著高于G/G 和T/T 表型的PSOS 患者。說明G/T 基因型能增加PCOS 患者并發(fā)肥胖、高雄激素血癥。其原因主要是由于代謝紊亂導(dǎo)致的LH/FSH比值異常，合成雄激素的關(guān)鍵酶-P450-17-α 碳酸酶活性增強(qiáng)從而使血清T 水平明顯升高。證實(shí)PCOS 患者AMH 基因型多態(tài)性不僅與PCOS 發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)還與其病理生理學(xué)研究相吻合。

表1 兩組患者的AMH 基因型、等位基因頻率比較[n（%）]

表 2 兩組的年齡、BMI、性激素水平比較

表 2 兩組的年齡、BMI、性激素水平比較

組別n 年齡（歲）BMI（kg/m2）29.1±3.5 28.7±3.1 1.408 0.296 E2（pg/ml） PRL（ng/ml） FSH（/mIUml） P（ng/ml） T（ng/dl）PCOS 組對(duì)照組t 值P 值100 100 24.2±2.3 21.8±1.8 10.064＜0.001 51.09±9.41 53.00±10.86 1.628 0.105 14.86±2.62 12.04±2.21 10.076＜0.001 5.57±0.92 6.83±1.22 10.099＜0.001 0.73±0.14 0.61±0.16 6.913＜0.001 59.66±11.72 28.43±5.09 29.934＜0.001

表3 Logistic 回歸分析結(jié)果

本研究結(jié)果顯示PCOS 患者FSH 水平下降，其原因可能是，PCOS 患者主要的臨床表現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)和不孕主要是由于卵泡發(fā)育障礙引起的[13]。PCOS 甾體激素代謝紊亂是PCOS 病理生理學(xué)變化的基礎(chǔ)。FSH 調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞芳香化酶活性受阻，雌二醇合成相對(duì)低下。有研究表明[14,15]PCOS 患者卵巢內(nèi)的芳香化酶活性正常甚至亢進(jìn)使雌二醇的合成增加。由于FSH 與雌二醇之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，PCOS 合成雌二醇能力亢進(jìn)反饋性抑制FSH 的合成。與本研究結(jié)果一致。提示 PCOS 患者卵巢本身的雌激素合成亢進(jìn)負(fù)反饋引起FSH 降低是導(dǎo)致PCOS 相關(guān)臨床癥狀的始發(fā)因素。同時(shí)本研究結(jié)果顯示 PRL、P、T 的水平、AMH 基因中 GT 基因型增高、卵泡雌激素（FSH）水平降低是并發(fā)PC OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。提示 PRL、P、T 的水平、AMH 基因中GT 基因型增高、卵泡雌激素(FSH)水平降低是并發(fā)PCOS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，上述指標(biāo)的變化應(yīng)警惕PCOS 并及時(shí)診治。

綜上所述，AMH 基因型中G/T 將會(huì)加大PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。其發(fā)病可能不受年齡的影響,需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本以研究年齡對(duì)PCOS 發(fā)病的影響。