黃逸之，唐銘余，鐘旻依，王芮嘉，陳嘉怡，葉云天，張新全，聶 剛*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130）

基因表達(dá)分析已廣泛運(yùn)用于新基因預(yù)測、基因功能研究等方面。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）能準(zhǔn)確定量地分析目標(biāo)基因的表達(dá)，在檢測基因表達(dá)方面具有重要作用[1]。與傳統(tǒng)的基因檢測方法相比，實時熒光定量PCR靈敏度高、特異識別性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確[2-3]。然而，qRT-PCR相對定量表達(dá)結(jié)果的準(zhǔn)確性受多種因素的影響，如RNA反轉(zhuǎn)錄合成效率、RNA質(zhì)量、擴(kuò)增效率和分析方法等[4-5]。為避免此類誤差的產(chǎn)生，在進(jìn)行實時熒光定量PCR分析時，需引入特異性好、表達(dá)穩(wěn)定的高質(zhì)量內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)進(jìn)行校正[6]。通常，高質(zhì)量內(nèi)參基因可以在不同試驗條件、不同組織、細(xì)胞都穩(wěn)定表達(dá)，通常為看家基因[7]，如 β 微管蛋白（tubulin，TUB），肌動蛋白（β-actin，ACTIN），蛋白磷酸酶 2A（Protein Phosphatase 2A，PP2A），多聚泛素酶基因（UBQ），轉(zhuǎn)錄延伸因子（transcription elongation factors，EF-1a）以及 18S 核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）等基因[8-9]。但越來越多的研究表明，在一定試驗條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，其穩(wěn)定性會隨試驗條件的變化而變化[10-11]，在任何試驗條件下都穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因很少[12]。因此，針對不同的植物、組織及試驗處理，篩選表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因很有必要。

芒（Miscanthus sinensis）是禾本科芒屬多年生高草本植物，光合碳固定效率高，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，適宜在邊際土地上種植，具有很大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價值[13]。邊際土地易受干旱、重金屬等非生物脅迫的影響，而芒根系發(fā)達(dá)，生物量大，抗氧化和光合能力強(qiáng)，且根系具有多種有益微生物輔助芒吸收養(yǎng)分，分泌有機(jī)酸，從而有利于芒應(yīng)對重金屬等非生物脅迫[14]。目前，有關(guān)植物進(jìn)行非生物脅迫下內(nèi)參基因篩選的研究報道很多，如多年生黑麥草（Lolium perenne）[15]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[16]、番茄（Lycopersicon esculentum）[17]、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）[18]等，但對于芒內(nèi)參基因篩選的研究報道相對較少。因此，有必要根據(jù)芒的不同組織和不同的試驗處理，篩選不易受外源性或內(nèi)源性因素影響的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究中，通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析比較12個候選內(nèi)參基因在芒根組織中不同非生物脅迫（干旱、鹽、鎘、鉻和砷）下的表達(dá)穩(wěn)定性，運(yùn)用 geNorm（ver.3.5）[19]、NormFinder（ver.0.953）[20]、BestKeeper（ver.1.0）[21]和 RefFinder[22]程序軟件以及ΔΔCt法[23]分析試驗數(shù)據(jù)，以期獲得不同脅迫條件下芒根組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為“M20100819”和“M20101302”兩個野生芒品種，分別采自海拔高度差異較大的兩地:四川省雅安市天全縣二郎山和眉山市洪雅縣（N 29°57′30.1″，E 102°24′36.4″，1388m；N 29°53′22.6″，E 103°21′59.2″，483.5 m）。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與脅迫處理

在濾紙上發(fā)芽芒種子后，移栽到塑料杯（直徑9 cm）中進(jìn)行沙培，用1X的Hoagland’s營養(yǎng)液在植物生長室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為白天28℃進(jìn)行12 h，夜間25℃進(jìn)行12 h。待植株長到5到6葉時對材料分別進(jìn)行干旱脅迫、鹽脅迫、砷脅迫、鉻脅迫和鎘脅迫處理。干旱脅迫采用20%PEG 6000模擬，鹽脅迫用300 mmol/L NaCl處理，砷、鉻、鎘3個重金屬脅迫分別用含200 mg/L As5+（Na2HASO4·7H2O）、200 mg/L Cr6+（K2Cr2O7）、200 mg/L Cd2+（CdCl2·2.5H2O）的霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行處理。所有處理均持續(xù)6 d，并在處理的第0、1、3、6天對不同脅迫處理分別取樣，將植株洗凈取其根組織，液氮冷凍，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取與cDNA合成

采用Direct-zolTMRNA MiniPrep試劑盒并按照其說明書提取芒根組織的總RNA。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，檢測合格的RNA采用iScript cDNA SynthesisKit試劑盒（Bio-Rad Laboratories Inc.）按說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄程序為:25℃啟動5 min，46℃開始反轉(zhuǎn)錄20 min，95℃反轉(zhuǎn)錄失活1 min，最后于4℃保存。cDNA產(chǎn)物在-20℃儲藏備用。

1.2.3 候選內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計

本試驗選擇以下12個內(nèi)參基因作為芒的候選內(nèi)參基因:18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、ACTIN、蛋白磷酸酶 2A（Protein Phosphatase 2A，PP2A）、真核起始因子 4a（Eukaryotic initiation factor 4 alpha，eIF4a）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthase，SAMS）、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC）、Sb09g019750、Sb02g041180及從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的 3個 unigene:Unigene33312、Unigene33024和Unigene26576（NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫編號:SRP102136）。通過同源基因序列比對后，使用在線軟件primer 3.0（http://primer3.ut.ee/）對候選內(nèi)參基因的引物進(jìn)行設(shè)計。其中Sb09g019750和Sb02g041180的引物參考于前人對芒屬植物的研究[24]（表1）。

表1 12個候選內(nèi)參基因引物序列及相關(guān)信息Table 1 Primer sequences and related information for 12 candidate reference genes

1.2.4 qRT-PCR反應(yīng)

將cDNA產(chǎn)物稀釋3倍，作為實時熒光定量PCR的模板，對12個內(nèi)參基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。配制的熒光定量PCR總反應(yīng)體系共10 μL:SsoAdvanced Universal SYBR? Green Supermix（2X）5 μL，上游下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板1.5 μL及2.5 μL的Nuclease H2O。qRT-PCR擴(kuò)增過程:95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性 10 s，60℃延伸 30 s，35個循環(huán)。為驗證每種引物的特異性，進(jìn)行了Tm分析。所有qRT-PCR反應(yīng)均做了3個技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)由實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）讀取，并為每對引物構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定每對引物的擴(kuò)增效率和回歸系數(shù)（R2）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究使用4種軟件工具geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder來分析12個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。geNorm軟件對候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值（average expression stability value，M）進(jìn)行分析并排序，M值越低的基因越穩(wěn)定。一般認(rèn)為M值低于1.5的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定，可作為理想內(nèi)參[25]。該軟件還可通過對內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值進(jìn)行排序，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化因子配對差異分析Vn/Vn+1判定最適內(nèi)參基因的數(shù)量。NormFinder軟件根據(jù)12個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性篩選出最優(yōu)內(nèi)參基因[20]。此外，可以通過BestKeeper軟件計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）來確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，CV值越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定[21]。由于這3種方法的分析結(jié)果存在一定的差異性，故使用在線網(wǎng)絡(luò)工具RefFinder進(jìn)行綜合分析，并將其作為整體的最終排名，從而篩選出在不同脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗證

以芒根組織材料RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，對12個內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結(jié)果顯示，所有基因擴(kuò)增引物目標(biāo)片段均為單一清晰可辨條帶，且條帶大小與預(yù)期大小一致。表明引物能特異性擴(kuò)增且不存在引物二聚體，適用于qRT-PCR研究。

2.2 不同非生物脅迫條件下內(nèi)參基因的Ct值分析

利用Ct法測定12個內(nèi)參基因在不同非生物脅迫下的相對表達(dá)量，從而分析內(nèi)參基因間轉(zhuǎn)錄水平的高低。Ct值（cycle threshold）與基因表達(dá)豐富度密切相關(guān)，Ct值越小，表達(dá)豐度越高[26]。Ct值比較結(jié)果顯示，各個內(nèi)參基因的表達(dá)水平存在一定的差異（圖2）。12個候選內(nèi)參基因的Ct值處于7.27到34.59之間，其中18S rRNA的表達(dá)豐度最高，Unigene33312表達(dá)量最低，其他候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度介于中間水平。

圖1 12個候選內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR results for twelve candidate reference genes

圖2 候選內(nèi)參基因在不同非生物脅迫環(huán)境下的平均Ct值Figure 2 All candidate reference genes in the different abiotic stress environments mean Ct values

2.3 geNorm分析

geNorm軟件分析結(jié)果顯示:在鉻脅迫處理下，所有候選內(nèi)參基因的M值都小于1.5，表明12個候選內(nèi)參基因均能穩(wěn)定表達(dá)，穩(wěn)定性排名前兩位的內(nèi)參基因為PP2A和Sb09g019750；在干旱脅迫和鹽脅迫下，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為Unigene33024和 Unigene26576 、Unigene26576和 Sb09g019750；在重金屬鎘脅迫和重金屬砷脅迫處理下，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是PP2A和Unigene26576、PP2A和Sb09g019750；而在考慮所有樣本的情況下，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Unigene26576和Unigene33024（圖 3）。

圖3 12個候選內(nèi)參基因在geNorm分析下的表達(dá)穩(wěn)定性值（M）Figure 3 Expression stability values（M）of 12 candidate reference genes by geNorm

此外，geNorm程序還能基于成對變異分析確定所需的最佳內(nèi)參基因數(shù)量。geNorm軟件可用于分析內(nèi)參基因的配對差異值（Vn/Vn+1），軟件分析默認(rèn)值為0.15。當(dāng)Vn/Vn+1大于0.15時，需要引入第n+1基因；當(dāng)Vn/Vn+1小于0.15時，無須引入新的內(nèi)參基因[19]。本次試驗中，所有樣品的V2/3小于0.15，則該試驗條件下的最適內(nèi)參基因數(shù)目是2個。鉻脅迫下的成對變異（V2/3）小于0.15，表明使用兩個最穩(wěn)定的內(nèi)參基因（PP2A和Sb09g019750）可以足夠。干旱脅迫、鎘脅迫、砷脅迫、鹽脅迫的成對變異（V3/4）均大于0.15，這表明可能需要4個內(nèi)參基因來進(jìn)行精確的歸一化（圖4）。

2.4 NormFinder分析

本研究利用NormFinder軟件分析12個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，內(nèi)參基因具有較低的穩(wěn)定值表明該基因更穩(wěn)定（表2）。根據(jù)NormFinder軟件分析結(jié)果可知:在所有樣品中，Unigene26576的穩(wěn)定值最低，為最佳內(nèi)參基因。而不同脅迫處理的水平不同，在鎘和鉻脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為Unigene33312；干旱脅迫下GAPDH最穩(wěn)定，其值為0.470；鹽脅迫和砷脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為Sb02g041180和 Sb09g019750。比較NormFinder和geNorm，ΔΔCt法的結(jié)果，雖然排名各有一些不同，但最穩(wěn)定的前5名內(nèi)參基因幾乎相同，總體趨勢一致。

圖4 geNorm通過成對變異（V）分析計算最佳內(nèi)參基因數(shù)Figure 4 geNorm calculated the optimal number of reference genes by pairwise variation （V）analyses.

2.5 BestKeeper分析

BestKeeper通過計算候選內(nèi)參基因的CV±SD值，結(jié)果以升序排序，值越小的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。通過結(jié)果分析（表3），在所有樣品中Sb02g041180（4.07±0.40）最穩(wěn)定，當(dāng)考慮不同處理時，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因各不相同:干旱脅迫下為ACTIN（2.17±0.65）；鹽脅迫下是 Sb09g019750（4.02±0.40）；砷脅迫和鎘脅迫下均為Unigene26576；鉻脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Unigene33312（12.56±0.45）。整體來看，BestKeeper分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果排名同以上3種算法結(jié)果基本一致。

2.6 RefFinder分析

使用在線網(wǎng)絡(luò)工具RefFinder綜合評估和篩選內(nèi)參基因。結(jié)果顯示（表4），干旱脅迫處理下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Sb02g041180和ACTIN；鹽脅迫處理下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Sb09g019750和Unigene26576；3種重金屬（砷、鎘、鉻）脅迫處理下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為Sb09g019750和PP2A、Uni-gene26576和 PP2A、Sb09g019750和 Unigene33312。而在所有樣本中，Unigene26576和Unigene33024是最理想的內(nèi)參基因，18S rRNA和SAMS是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

表2 12個候選內(nèi)參基因在NormFinder分析下的表達(dá)穩(wěn)定值Table 2 Expression stability values of 12 candidate reference genes calculated by the NormFinder

表3 12個候選內(nèi)參基因在BestKeeper分析下的表達(dá)穩(wěn)定值Table 3 Expression stability values of 12 candidate reference genes determined via BestKeeper.

表4 12個候選內(nèi)參基因的綜合排名Table 4 The comprehensive ranking of 12 candidate reference genes

3 討論與結(jié)論

在不同的植物、組織和試驗條件下，最優(yōu)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性不同[27]。Huang L.等[28]發(fā)現(xiàn)，在澇脅迫下，鴨茅（Dactylis glomerata L.）葉組織中 CYP2是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而蔣曉梅等[29]證實，在相同條件下，鴨茅根組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是TCTP。冷脅迫下，柳枝稷（Panicum virgatum）葉組織中UBC表達(dá)穩(wěn)定性最好[30]，而根組織中ACTIN表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)[31]。研究表明，內(nèi)參基因除了在不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性不同，在不同植物中也具有表達(dá)差異。ACTIN在油菜[32]（Brassica napus）中表達(dá)穩(wěn)定性較差，而相同條件下在檸條錦雞兒[33]（Caragana Korshinskii）中表達(dá)穩(wěn)定性較好。此外，葉新如等[34]研究了冬瓜（Benincasa hispida）的7個候選內(nèi)參基因在不同非生物脅迫處理葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，不同脅迫處理下，表達(dá)最穩(wěn)定內(nèi)參基因也不同，高溫脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的是UBQ基因，而干旱脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的則是TUA基因。

近年來，越來越多的研究選擇從本物種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選內(nèi)參基因。Yang C.L.等[35]通過分析圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii）3個不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出3個穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因:EkUBC23、EkCYP38和EkGAPDH2。Liu Q.等[36]在多花黑麥草（Lolium multiflorum L.）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到在鹽堿脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Unigene14912。本研究候選的unigene中Unigene26576在鎘脅迫下和所有樣本中表達(dá)最穩(wěn)定，表明了其作為芒新內(nèi)參基因的應(yīng)用潛力，同時證明了基于本物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選內(nèi)參基因的可行性。此外，通過RefFinder軟件分析發(fā)現(xiàn)在鹽、砷和鉻3種脅迫下，芒根組織最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Sb09g019750。然而Zhong M.等[37]證實，RefFinder鑒定下芒葉組織中Sb09g019750基因在鹽和鉻脅迫處理下沒有表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，這表明在同一植物的不同組織中，內(nèi)參基因也具有表達(dá)差異。在實時熒光定量PCR分析中，常選擇功能較穩(wěn)定的管家基因用于試驗分析。侯維海等[38]對地黃（Rehmannia glutinosa）實時定量PCR內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示18S rRNA表達(dá)豐度最高。而一些研究發(fā)現(xiàn)管家基因在某些植物中存在表達(dá)不穩(wěn)定的情況。比如，在本研究中，18S rRNA在所有非生物脅迫下表達(dá)均不穩(wěn)定，在鹽、砷、鎘脅迫下穩(wěn)定性最差。因此，驗證候選內(nèi)參基因在不同植物、組織及試驗條件下的表達(dá)穩(wěn)定性，選擇最適內(nèi)參基因是保證試驗結(jié)果準(zhǔn)確性的前提保障。

本研究使用 geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件分析試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示3種分析方法在鑒定最穩(wěn)定內(nèi)參基因時存在排序差異，這可能與不同程序使用不同算法而產(chǎn)生的差異有關(guān)。如王寧航等[39]對望春玉蘭內(nèi)參基因篩選時發(fā)現(xiàn)，使用geNorm和NormFinder兩種軟件分析結(jié)果具有較高相似性，分析得到的最佳內(nèi)參基因為MbTEF，最差的內(nèi)參基因為MbUBC，而BestKeeper軟件分析結(jié)果與二者差異較大，該軟件篩選得到的最佳內(nèi)參基因為MbCYP。在本研究中，分析結(jié)果與其大致相似。geNorm和NormFinder鑒定下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為Unigene26576，而BestKeeper分析發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Sb02g041180，最不穩(wěn)定的基因和geNorm和NormFinder篩選結(jié)果相同，均為18S rRNA。目前對于使用哪個軟件能夠更加科學(xué)準(zhǔn)確地評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性并沒有公認(rèn)的經(jīng)驗，為此我們利用線上網(wǎng)絡(luò)工具RefFinder對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。結(jié)果顯示，在所有樣本中，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Unigene26576和Unigene33024，此結(jié)果與 geNorm分析結(jié)果一致。同時，使用以上4種分析軟件檢測18S rRNA的穩(wěn)定性均較差。因此，利用不同的軟件分析試驗數(shù)據(jù)，并比較不同的算法差異能更加準(zhǔn)確地篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

本研究對芒根組織在不同非生物脅迫下12個候選內(nèi)參基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在鹽、砷、鉻脅迫下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Sb09g019750；在干旱脅迫下，Sb02g041180基因穩(wěn)定性最高，其次為ACTIN；在鎘脅迫下，Unigene26576基因穩(wěn)定性最高，PP2A其次。綜合數(shù)據(jù)顯示，Unigene26576和Unigene33024為芒根組織在不同非生物逆境下的最適內(nèi)參基因。此為芒在不同脅迫下的進(jìn)一步研究提供了合適的候選內(nèi)參基因，為開展芒功能基因表達(dá)奠定了一定的基礎(chǔ)。