馮吉 程玲 蔡長(zhǎng)春 孫光偉 孫敬國(guó) 楊錦鵬 李建平 陳振國(guó)

摘要：CRISPR/Cas9是一種重要的基因組定向編輯技術(shù)，近年來在植物基因組的定向敲除和分子育種材料創(chuàng)制中得到了廣泛應(yīng)用。為了發(fā)掘可用于分子育種的低煙堿煙草，以烤煙品種K326為試驗(yàn)材料，利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)控制煙草煙堿合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的5個(gè)基因（PMT1、QPT、A0622、MNUP1和、JA47）進(jìn)行定向敲除，并對(duì)T2代純合基因型煙草植株進(jìn)行煙堿含量檢測(cè)。結(jié)果表明，定向敲除5個(gè)基因后獲得100株成功編輯的1T0代煙草植株，突變檢出率為299%，突變類型以單堿基插入或刪除為主。對(duì)定向敲除煙堿合成基因P72和轉(zhuǎn)運(yùn)基因JAT1的T1代純合基因型煙草植株進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)存在4種突變類型，分別是插入一個(gè)T、C、A堿基的插入突變和一個(gè)缺失44個(gè)堿基的缺失突變，從而引發(fā)移碼使得翻譯的氨基酸鏈大幅縮短，其T2代植株上部葉煙堿含量顯著低于野生型植株。綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)能夠高效定向敲除煙堿關(guān)鍵基因，為低煙堿煙草分子育種提供了理論和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：基因;編輯技術(shù);突變;煙堿

基因組編輯技術(shù)是近年在基因組水平上進(jìn)行精確修飾的一種技術(shù)，該技術(shù)可對(duì)基因進(jìn)行定向敲除、敲入、多位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段的缺失等。與傳統(tǒng)的誘變育種相比，通過該技術(shù)獲得的遺傳修飾生物材料與自然界長(zhǎng)期進(jìn)化形成的各類天然多態(tài)性個(gè)體相比不存在本質(zhì)區(qū)別，且精確性更高、周期更短，最終達(dá)到的效果等同于天然誘變、人工誘變和傳統(tǒng)雜交導(dǎo)入基因片段。目前美國(guó)政府已于2012年批準(zhǔn)了首個(gè)基因組定向修飾獲得的植物材料作為常規(guī)品種進(jìn)行田間評(píng)價(jià)。

CRISPR/Caso（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/crispr-associated nuclease 9，Cas）基因組編輯技術(shù)是第3代基因編輯技術(shù)101]，是通過RNA介導(dǎo)由Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的編輯。因CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、成本低、編輯效率高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，已在大量物種中得到了廣泛應(yīng)用171。CRISPR/Cas9技術(shù)在煙草研究領(lǐng)域上也有較多應(yīng)用，2015年高軍平等2首次在普通煙草中建立了CRISPR/Cas9技術(shù)體系，并對(duì)煙草MPDS和NPDR6基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。

謝小東等2利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得MPIN4（個(gè)腋芽生長(zhǎng)相關(guān)基因）的煙草突變體，并通過表型驗(yàn)證證實(shí)了該基因功能。姚恒等2采用CRISPR/Cas9技術(shù)定向敲除煙草Ntppo1基因，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示T2突變體中MPO1表達(dá)水平比對(duì)照顯著下降。謝小東等針對(duì)煙草5個(gè)基因構(gòu)建了多靶點(diǎn)敲除系統(tǒng)，結(jié)果表明CRISPR/Cas9多基因編輯系統(tǒng)可進(jìn)行有效突變煙草是一種傳統(tǒng)的模式植物和重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙堿含量是影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要指標(biāo)之-2因此，本研究采用CRISPR/Cast9基因組編輯技術(shù)，對(duì)5個(gè)控制煙堿含量基因（PMT1、OPT1、A622、NNUP1和.AT，其中PMT、QPT1及A622酶是煙堿合成途徑中的重要酶;NNUP1和JAT1則是煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白2）進(jìn)行定向敲除研究，并對(duì)所獲敲除成功的材料進(jìn)行基因功能研究，為發(fā)掘可用于煙草分子育種的煙草材料和煙草功能基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和種植地點(diǎn)

本研究選用烤煙品種K326為試驗(yàn)材料。K326無菌苗培養(yǎng)于湖北省煙草科學(xué)研究院的組織培養(yǎng)室;K326轉(zhuǎn)化植株種植在利川烤煙基地和海南三亞冬繁基地。

表達(dá)載體：pORE-Cas9/gRNA，由西南大學(xué)提供。主要的試劑：2xpower Tag PCR Mastermix和植物DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌DH5q感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101、限制性內(nèi)切酶BsaI、DNAMarker、T4連接酶、頭孢和卡那霉素購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司;引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成;PCR產(chǎn)物測(cè)序由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。主要儀器：PCR儀，akaraTP600（日本）;凝膠自動(dòng)成像儀，MS-UVCI（美國(guó)）;核酸蛋白測(cè)定儀，伯樂smartspecplus（美國(guó)）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1SGRNA（（singleguideRNA）設(shè)計(jì)利用中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫中PMT（AFI26810）、QP77（AJ748262）、A622（ABO71165）、NTNUP1（GU174267）和、JAT1（AM991692）基因的cDNA和genomicDNA序列，通過在線工具CRISPR Multitargeter（http：//www.multicrisprnet/index.html）501設(shè)計(jì)了15個(gè)CRISPR/Cas9敲除的SGRNA寡聚核苷酸序列（表1）。

1.2.2基因敲除靶位點(diǎn)的cDNA引物設(shè)計(jì)根據(jù)

15個(gè)SGRNA序列（表1），設(shè)計(jì)了15對(duì)可擴(kuò)增SGRNA序列的CDNA片段引物對(duì)（表2）。設(shè)計(jì)要求：引物的合成不需要PAM區(qū)（NGG）;不是以G開始的要加G;序列的反向互補(bǔ);之后分別在上游引物和下游引物的開頭添加GAT和AAAC序列（可與BsaI酶切表達(dá)載體形成的粘性末端互補(bǔ)）。

1.2.3載體構(gòu)建以設(shè)計(jì)好的靶位點(diǎn)序列作為正向引物，其反向互補(bǔ)序列作為反向引物，與經(jīng)Bsal酶切pORE-Cas9SGRNA表達(dá)載體形成的黏性末端互補(bǔ)。靶位點(diǎn)序列通過T4連接酶連接到表達(dá)載體上后，將DH5a感受態(tài)細(xì)胞加入連接產(chǎn)物中，使連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5q感受態(tài)細(xì)胞中。最后挑取單克隆作為模板，以載體上的引物JC-F（5TTAGGTTTACCCGCCAATA3）和靶位點(diǎn)的下游引物（表2）PCR擴(kuò)增和驗(yàn)證。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃10min;94C40s，53C40s，72C30s，30個(gè)循環(huán);72℃10min;4℃下保存。

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化和愈傷組織的篩選利用電轉(zhuǎn)法將重組編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。在超凈工作臺(tái)中將煙草無菌苗的成熟葉片切成1.0cm2左右的葉盤，然后將葉盤浸泡在攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌液中。農(nóng)杄菌侵染10min后，以葉盤上表面平鋪于MS固體培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下共培養(yǎng)48h。然后再將葉盤上表面平鋪于愈傷分化培養(yǎng)基上，在12h光照/12h黑暗條件組培室內(nèi)培養(yǎng)，約1個(gè)月后可以看到葉盤邊緣出現(xiàn)白色或綠色膨大的愈傷組織。待愈傷組織長(zhǎng)出綠芽后，切下綠芽（1～2cm高）并轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基生根，1個(gè)月后可移栽到土里2121.2.5煙草陽性苗檢測(cè)和目標(biāo)基因檢測(cè)煙草陽性苗的檢測(cè)：采取CTAB法提取煙草葉片總DNAP。根據(jù)載體中所包含的抗卡那霉素基因?yàn)槟繕?biāo)開發(fā)出特異引物對(duì)NPTI（左引物5CGTTGTCACTGAAGCGGGAAGG3;右引物5GAGCGGCGATACCGTAAAGCAC3）。以煙草株系葉片的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)的片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析確定是否為陽性苗。

目標(biāo)基因檢測(cè)：利用Primer5.0軟件在目標(biāo)基因的目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)引物。以煙草葉片的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的序列片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，分析目標(biāo)基因是否被基因編輯成功。

煙草煙堿檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析：將烤后煙樣取3份，每份15～20片，送湖北省煙草科學(xué)研究院進(jìn)行煙堿含量檢測(cè)。煙堿含量檢測(cè)采用氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過Microsoft Ofiice Excel2010和SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan法。

2結(jié)果

2.1陽性克隆檢測(cè)

通過載體構(gòu)建，總共獲得15個(gè)載體。對(duì)經(jīng)過卡那霉素篩選的15個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)驗(yàn)證，所用引物為JC-F和15個(gè)SGRNA的反向序列（表2）。如圖1所示，得到預(yù)期450bp左右大小的整齊清晰的目標(biāo)帶型，結(jié)果表明重組CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株內(nèi)，可用于下一步遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

2.2煙草T0代陽性苗的種植和檢測(cè)

在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，待幼苗長(zhǎng)至3-5片葉時(shí)，進(jìn)行取樣提取煙草基因組DNA，以特異引物對(duì)NPTⅡ（目標(biāo)基因?yàn)榭箍敲顾鼗颍┻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)部分結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示，1205株煙草再生植株中（包含所有15個(gè)轉(zhuǎn)化載體）有751株是T0代陽性苗，每個(gè)載體獲得轉(zhuǎn)化陽性苗有30-70株不等，陽性率達(dá)到62%，說明轉(zhuǎn)化試驗(yàn)成功率較高。2016年5月中上旬將751株中的460株T0代陽性轉(zhuǎn)化苗（包含所有15個(gè)轉(zhuǎn)化載體）從組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室移栽到利川烤煙基地。最終在烤煙基地只有334株1T0代煙草陽性植株存活（PMT基因：116株;OP7l基因：44株;A62基因：67株;MNUP1基因：59株;JAT基因：48株），存活率為72.6%（表3）。

對(duì)存活的34株煙草陽性植株（包含所有1個(gè)轉(zhuǎn)化載體）進(jìn)行取樣，然后通過PCR和測(cè)序技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)（表4），獲得100株成功編輯（即目標(biāo)基因發(fā)生突變）的T0代煙草植株，突變檢出率為299%（100334）。對(duì)于PMT1、A622和JA基因，3個(gè)靶位點(diǎn)中只有1個(gè)靶位點(diǎn)檢測(cè)到成功編輯的植株（PMT基因：51.7%，0，0;A622基因：0，0，609%;JAT1基因：96%，0，0），這可能發(fā)生了脫靶現(xiàn)象或是檢測(cè)的樣本數(shù)量不夠多。對(duì)于QPT2和MNUP1基因，3個(gè)靶位點(diǎn)都檢測(cè)到成功編輯的植株，但同一個(gè)基因不同靶位點(diǎn)間的突變檢出率卻有巨大的差異（QPT71基因：5%，667%，583%;MNUP基因：92%，43.5%，27.3%）。同時(shí)測(cè)序結(jié)果分析還顯示（表5），5個(gè)基因在靶位點(diǎn)處發(fā)生了多種形式的突變，包括在不同位點(diǎn)處的單堿基插入或刪除、多堿基替換和大片段缺失（10堿基以上）。PMT和QPT兩個(gè)基因的堿基突變類型主要以單堿基插入或刪除為主（占總突變類型的50%以上），其次是多堿基替換。A62和NTNUPI兩個(gè)基因的堿基突變類型主要以多堿基替換為主（占總突變類型的50%以上），其次是単堿基插入或刪除。T基因的堿基突變類型主要以單堿基插入或刪除為主（占總突變類型的70%以上），其次是大片段缺失（10堿基以上），最少的是多堿基替換。

對(duì)成功編輯的100株T0代煙草植株目標(biāo)基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因靶位點(diǎn)SGRNA-PAM之后的序列出現(xiàn)雙峰，說明Cas9蛋白在切斷靶位點(diǎn)序列后，每條DNA修復(fù)的情況不一樣，導(dǎo)致成功編輯的100株T0代煙草植株中突變型和野生型基因序列同時(shí)存在，即為嵌合體或雜合型植株。因此將這成功編輯的100株T0代煙草植株經(jīng)自交后產(chǎn)生T1代煙草種子，用于下一步的純合型突變體篩選。

2.3煙草T1代植株種植和檢測(cè)

2016年10月中上旬從100份T1代種子中選取6份在海南三亞基地冬繁（只包含OP7基因靶位點(diǎn)2的突變植株和AT基因靶位點(diǎn)1的突變植株，每個(gè)基因3份材料），每個(gè)T1代株系種植20個(gè)單株，總共120株。最終在海南三亞基地只有99株T1代煙草植株存活（QPTl基因，40株;JA77基因：59株），存活率為82.5%。通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序，對(duì)99株T1代煙草植株的目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)分析，其中55株成功編輯（OPT基因13株;JAT7基因42株），突變檢出率為55.6%。55株T1代煙草植株中，純合基因型有15株（QP7基因5株;T基因10株）;雜合基因型有40株（OPT基因8株;JHAT基因32株）。

對(duì)15株純合基因型T1代煙草植株的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析（圖3），結(jié)果顯示，QPT基因在靶位點(diǎn)處發(fā)生了2種類型的突變（圖3A，基因檢測(cè)引物對(duì)：左引物5I'GCAATTACAGCTTCCAAGGT.3';右引物5GCGCGAATCTGGATAGTTG3），一種是單堿基的插入（突變體Q1;插入一個(gè)T堿基），一種是單堿基的插入以及單堿基替換（突變體Q2;插入一個(gè)C堿基，T堿基替換為G堿基）。JAT1基因在靶位點(diǎn)處發(fā)生了2種類型的突變（圖3C，基因檢測(cè)引物對(duì)：左引物5GACAAGACAAGCCAACAAG3';右引物5AACACTGTGACCGCTACCAT3”），一種是單堿基的插入（突變體J1;插入一個(gè)A堿基），一種是44個(gè)堿基的缺失（突變體J2）。對(duì)這4種突變株系的編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)比對(duì)分析（圖3B和D），由于插入單個(gè)堿基或44個(gè)堿基的缺失，引發(fā)移碼致使提前遇到終止密碼子，使得翻譯的氨基酸鏈大幅縮短。因此，將這4種純合基因型T1代煙草植株自交收種，獲得T2代煙草種子用于功能驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.4煙草T2代植株基因功能驗(yàn)證

2017年5月中上句將這4種純合基因型T2代煙草植株（Q1，Q2，J1和J2）種植在利川烤煙基地，每個(gè)株系種植120個(gè)單株，以進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示（圖4），正常生長(zhǎng)條件下，這4種純合基因型T2代煙草植株與野生型植株表型上無顯著性差異。但通過檢測(cè)上部烤后煙葉煙堿發(fā)現(xiàn)，突變體Q1與Q2，或J1與J2上部煙葉煙堿含量相比較未達(dá)到顯著性差異;而突變體Q1和Q2與J1和J2相比較，Q1和Q2上部煙葉煙堿含量顯著低于J和J2;同時(shí)突變體Q1，Q2，J和J2上部煙葉煙堿含量顯著低于野生型植株上部煙葉煙堿含量。該結(jié)果表明利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制的OPT突變體和JA7突變體是成功的，煙堿合成基因OP77和煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因AT能夠顯著影響煙葉中煙堿的積累。

3討論

自從2013年CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)首次應(yīng)用于真核生物以后，已在各植物研究中進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用。2015年高軍平等2首次在普通煙草中建立了CRISPR/Cas9技術(shù)體系，隨后該技術(shù)在煙草各種性狀研究中進(jìn)行了探索和應(yīng)用。本研究直接將該技術(shù)應(yīng)用于煙草煙堿研究中并最終獲得4種低煙堿純合基因型2代煙草植株，該研究結(jié)果有助于煙草煙堿硏究和低煙堿分子育種的深入開展。

利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，對(duì)控制煙草煙堿合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的5個(gè)基因進(jìn)行基因編輯，獲得100株成功編輯的煙草T0代植株，其中突變類型為單堿基插入或刪除所占比例最大（50%以上），與之前研究結(jié)果基本一致29-30。對(duì)于PMT1、A622和J基因，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)靶位點(diǎn)未檢測(cè)到成功編輯的植株，可能發(fā)生了脫靶現(xiàn)象。造成脫靶現(xiàn)象的主要因素可能是SGRNA引起的錯(cuò)配或PAM序列引起的錯(cuò)配導(dǎo)致了脫靶，因此通過提高SORNA的特異性、改造Cas9蛋白或者降低Cas9和SGRNA在植物中的表達(dá)水平可以有效降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生51-3。然而在植物研究中脫靶并不是一個(gè)特別關(guān)注的問題，因?yàn)槊摪性斐傻钠渌蛐蛄械耐蛔兾⒉蛔愕?，其突變純合或雜合后代也沒發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步突變產(chǎn)生。而且即使發(fā)生了非特異性的定點(diǎn)突變，也可通過回交的方法將非特異性的定點(diǎn)突變進(jìn)行回復(fù)2。對(duì)于OPT2和MNUP1基因，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)基因不同靶位點(diǎn)間的突變檢出率有巨大的差異，可能是SGRNA序列中靠近PAM區(qū)的第8至12個(gè)堿基之間的差異性對(duì)Cas9蛋白剪切精確性的影響造成的。還可能是一個(gè)靶位點(diǎn)在正向鏈上而另一個(gè)是在互補(bǔ)鏈上造成的2，比如QP7基因靶位點(diǎn)1在正向鏈上，靶位點(diǎn)3在互補(bǔ)鏈上，它們之間的突變檢出率相差有10倍多。

通過檢測(cè)野生型和4種純合基因型T2代煙草植株烘烤后上部煙葉煙堿含量，發(fā)現(xiàn)突變體J和J2與Q1和Q2相比較，J和J2上部煙葉煙堿含量顯著高于Q1和Q2?？赡苁且?yàn)闊焿A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白JAT1與NTMATE1/2之間有部分功能相似度2，當(dāng)突變體J1和J2中.MATl基因功能喪失后NTMATE1/2基因可替代其部分功能;也可能是煙堿合成基因OP7的功能對(duì)煙葉煙堿的影響大于煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因JAT12。同時(shí)突變體Q1，Q2，J1和J2上部煙葉煙堿顯著低于野生型植株相應(yīng)部位煙葉煙堿，說明單個(gè)煙堿合成基因和煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因功能喪失后能夠顯著影響煙葉煙堿的積累。由于本研究中普通栽培煙草是異源四倍體，在進(jìn)化史上經(jīng)歷過多倍化的過程，絕大部分基因都有多個(gè)拷貝9733，因此單獨(dú)敲除一個(gè)煙堿合成基因或煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因后，可能會(huì)由其他拷貝基因在功能上互補(bǔ)，造成突變體煙草植株煙堿含量顯著降低但不會(huì)降低到趨近為零;所以在后續(xù)煙草煙堿研究中，還需要利用CRISPR/Cast9介導(dǎo)煙草多基因編輯技術(shù)，創(chuàng)制出多基因突變體，才能更全面地研究煙草煙堿相關(guān)基因功能。

4結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)控制煙草煙堿合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的5個(gè)基因進(jìn)行了定向敲除，最終成功獲得4種低煙堿純合基因型T2代煙草植株并進(jìn)行了功能研究。結(jié)果表明利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制的OP7突變體和T突變體的上部煙葉煙堿含量顯著降低，且煙堿合成基因QPT對(duì)煙堿的影響大于煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因JT，該結(jié)果為后續(xù)低煙堿煙草分子育種奠定了材料基礎(chǔ)。雖然本研究中CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)展示出簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)的脫靶問題和多拷貝基因靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)問題目前尚未得到徹底解決。因此在未來的研究中應(yīng)對(duì)CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)，使該技術(shù)具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

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