楊志曉 王軼 謝升東 鄭少清 夏海乾 陳懿 余世洲 王自力 曹毅 王仁剛 董祥立 李治模 張維軍 林英超

摘要：為進(jìn)一步明確煙株內(nèi)源激素與赤星病抗性的關(guān)系，以抗赤星病煙草品種凈葉黃和感病品種長脖黃為研究對象，通過盆栽種植并接種赤星病菌，比較不同抗性品種內(nèi)源激素含量對赤星病脅迫的響應(yīng)差異。研究結(jié)果顯示，在赤星病脅迫下，凈葉黃、長脖黃的脫落酸（ABA）含量和乙烯（ET）釋放量均呈上升趨勢，而生長素（IAA）以及細(xì)胞分裂素（CIK）含量表現(xiàn)為降低。同時(shí)，赤星病脅迫導(dǎo)致凈葉黃的赤霉素（GA）、茉莉酸（JA）含量增加，引起長脖黃的JA含量降低，GA含量則先增加后降低。與凈葉黃相比，長脖黃的ABA含量增幅較小，而GA、IAA、CTK與JA含量降幅較大，并且ET釋放量較高。綜上，在赤星病脅迫下，內(nèi)源激素的含量差異以及變化幅度可以反映不同品種的抗病能力。

關(guān)鍵詞：赤星病脅迫;內(nèi)源激素;煙草;品種;抗病性

植物體中存在的內(nèi)源激素主要包括脫落酸、乙烯、生長素、細(xì)胞分裂素以及赤霉素等不同類別物質(zhì)，每一種類的激素都在一定濃度范圍對植株的生長發(fā)育進(jìn)程產(chǎn)生調(diào)控作用。植物內(nèi)源激素可以參與抵御病原菌侵染，誘導(dǎo)寄主的防御反應(yīng)，避免或者械輕病原菌所造成的危害，與抗病性存在緊密聯(lián)系。徐以華等指出，在水稻與穗枯病菌互作反應(yīng)中，穗枯病菌能夠誘導(dǎo)一系列內(nèi)源激素含量發(fā)生改變，且這種誘導(dǎo)效應(yīng)在抗病品種中更為明顯。鐘麗娟等研究發(fā)現(xiàn)，煙株在感染馬鈴薯Y病毒后，IAA含量顯著降低，且感病品種的下降幅度大。在灰斑病菌作用下，大豆葉片的IAA含量升高有利于品種抗病能力增強(qiáng)，但感病品種的IAA、GA含量卻出現(xiàn)降低?；诖耍钊敕治鰞?nèi)源激素在植物抵御病原菌侵染過程中的作用對于病害防治工作具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

煙草赤星病是由鏈格孢菌Alternaria alternate（Fries）Keis引起的一種真菌性病害，能夠?qū)熑~生產(chǎn)造成巨大損失。目前有關(guān)煙草受到赤星病侵染后其內(nèi)源激素的變化規(guī)律尚未見報(bào)道。因此，本研究選擇2個(gè)具有不同赤星病抗性的煙草品種作為試驗(yàn)材料，分析抗、感病品種在赤星病脅迫條件下其內(nèi)源激素包括脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、生長素（IAA）、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（CK）含量與乙烯（ET）釋放量的差異，旨在探討煙草內(nèi)源激素與赤星病抗性的關(guān)系，為抗病煙草品種培育與病害的科學(xué)防治提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料分別為高抗、高感煙草赤星病煙草品種凈葉黃（JYH）、長脖黃（CBH）。JYH是由CBH的抗赤星病單株經(jīng)系統(tǒng)選育而成，該品種為我國抗赤星病育種的主要抗源，利用其作為親本已培育出多個(gè)高抗或耐病品種。

選擇具較高致病性的煙草赤星病菌種GM831

做為人工接種使用的赤星病菌株，該菌株由貴州省煙草科學(xué)研究院植保團(tuán)隊(duì)提供。

內(nèi)源激素ABA、GA、IAA、CTK和JA所用檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

2020年在貴州省煙草科學(xué)研究院開展盆栽試驗(yàn)。漂浮育苗，在6葉1心時(shí)選擇生長整齊、均勻一致的壯苗移栽至裝有10kg土的聚乙烯盆中，每盆內(nèi)植煙1株，盆栽的行距、株距按照1.1m、0.55m排列。每個(gè)品種重復(fù)3次，每重復(fù)種植50株。盆栽壤為壤質(zhì)潮土（有機(jī)質(zhì)8.52gkg、全氮0.89gkg、速效氮66.46mgkg、速效磷24.43mgkg、速效鉀108.15mgkg、pH792）。每盆煙株所用N、P、K的施入量依次是0.13、0.13以及0.39gkg，肥料共分3次（移栽時(shí)、移栽后第1周以及第2周）施入盆內(nèi)，3次施肥比例為2：1：1。在移栽后50d現(xiàn)蕾時(shí)打頂，單株留葉18片。

將赤星病菌于PDA固體培養(yǎng)基內(nèi)在25℃環(huán)境條件中連續(xù)培養(yǎng)7d。待充分產(chǎn)生孢子后，加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的無菌葡萄糖溶液浸泡15min;用滅菌后的棉簽在PDA培養(yǎng)基表面輕刮后將孢子與菌絲體從培養(yǎng)基內(nèi)洗出，通過4層無菌紗布充分過濾除掉菌絲體，最后用1%的無菌葡萄糖溶液配制成濃度達(dá)到1.0×10個(gè)mL的煙草赤星病菌孢子懸浮液用于下一步的人工接種。

1.3試驗(yàn)處理

在移栽后50d，掛牌標(biāo)記2個(gè)品種第3、4葉位的葉片（由下往上數(shù)，下同），使用孢子懸浮液噴霧方式開展接種（所用的孢子懸浮液于人工接種時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配），每個(gè)品種每個(gè)重復(fù)選擇25株煙苗用于赤星病菌接種。采用小型手持噴霧器將孢子懸浮液噴酒至葉片上，使孢子懸浮液在葉面上呈現(xiàn)均勻分布卻不下滴的程度，1%無菌葡萄糖溶液處理作為試驗(yàn)對照。接種后將煙株置于人工氣候室中，25℃黑暗環(huán)境下保濕24h，然后開展正常的生長管理，使晝夜溫度保持在27℃/23℃，相對濕度為70%。在接種后0、3、6、9、12d，每天9：3010：30采用隨機(jī)方式進(jìn)行取樣，2個(gè)品種每個(gè)重復(fù)每次分另取樣3片，將葉片去除主、側(cè)脈并用錫箔紙包裹，利用液氮快速冷凍后置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于內(nèi)源激素含量測定，重復(fù)3次。

1.4內(nèi)源激素測定方法

取煙草葉片1g，加入8倍量80%預(yù)冷甲醇在4℃黑暗條件下浸泡24h。此后在4℃下18800g離心10min，收集上清液;殘?jiān)尤爰状迹w積比1：5）重復(fù)提取2次。獲得的上清液合并后再次離心10min。將離心后的上清液通過C18小柱，然后依次加入1mL磷酸緩沖液（pH3.0）和乙酸乙酯，等體積萃取3次，把上層乙酸乙酯相經(jīng)真空干燥后濃縮，此后加入2mL甲醇進(jìn)行溶解，最后經(jīng)0.45um有機(jī)系微孔濾膜過濾，將收集的樣品在1100LC型高效液相色譜儀（AgilentInc，USA）上測定ABA、GA、IAA、CTK及JA含量，檢測器為二極管陣列檢測器（DAD）。

ET釋放量參照楊暹等的方法進(jìn)行測定。在接種后0、3、6、9和12d，2個(gè)處理分別取煙葉8片（第3、4葉位），立即放入500mL三角瓶中，室溫下密封3h后抽氣1min，用HIITACHII163型氣相色譜儀測定，每個(gè)處理重復(fù)3次，每一重復(fù)抽氣3針。氣相色譜參數(shù)設(shè)定為：火焰離子化檢測器FD色譜柱溫90℃，色譜進(jìn)樣器溫度100℃，載氣是N2，流速25mL/min利用純乙烯繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的色譜峰值經(jīng)過換算得到ET釋放量。ET釋放量=乙烯濃度（三角瓶體積煙草葉片體積（密封時(shí)間×煙草葉片重量）×0.8×儲溫。

1.5數(shù)據(jù)分析

使用SPSS17.0軟件與MicrosoftExcel2013對所測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，采用Duncans新復(fù)極差檢測法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2結(jié)果

2.1赤星病脅迫對抗、感病煙草品種ABA含量的影響

正常生長條件下，2個(gè)品種的ABA含量隨煙株生長發(fā)育均上升（圖1）。與對照相比，赤星病脅迫致使抗、感病品種的ABA含量均顯著增加（p《0.05）。在脅迫3、6d時(shí)，JYH的ABA含量分是CBH的1.04、1.05倍，達(dá)到顯著差異水平（p《0.05）。此后，CBH的ABA含量大幅度上升;在脅迫9、12d時(shí)，CBH的ABA含量分別是JYH的1.06、1.11倍，差異也達(dá)到顯著水平（p《0.05）。

2.2赤星病脅迫對抗、感病煙草品種GA含量的影響

正常環(huán)境中，隨著煙株生長發(fā)育，2個(gè)品種的GA含量均下降，但降低幅度較小（圖2）。赤星病脅迫使JYH的GA含量顯著高于對照（p《0.05），而CBH的GA含量表現(xiàn)出先緩慢增加后急劇下降的變化趨勢，且在處理3d時(shí)達(dá)到最大值，為對照的1.16倍，JYH的1.09倍，均達(dá)到顯著差異水平（p《005）。在赤星病脅迫6-12d時(shí)，JYH的GA含量始終顯著高于CHB（p《0.05），分為CBH的1.50、2.12和3.36倍。

2.3赤星病脅迫對抗、感病煙草品種IAA含量的影響

如圖3所示，在接種赤星病菌后，不同抗性品種的IAA含量均出現(xiàn)降低。脅迫12d時(shí)，與對照相比，JYH、CBH的IAA含量降幅分別為7.09%、79.44%在脅迫3～12d時(shí)，JYH的IAA含量始終顯著高于CBH（《0.05），分別是CBH的0.98、1.36、1.50和4.60倍。

2.4赤星病脅迫對抗、感病煙草品種CK含量的影響

正常條件下，不同抗性品種的CTK含量均呈緩慢下降趨勢（圖4）。在脅迫3-9d時(shí)，JYH的CTK含量與對照無顯著差異;在脅迫12d，降幅達(dá)到22.79%，與對照相比差異顯著（《0.05）。赤星病脅迫使CBH的CTK含量急劇下降，顯著低于對照（p《0.05）。在脅迫3-12d時(shí)，JYH的CTK含量分別為CBH的137、1.47、1.67和1.74倍，且均呈顯著差異水平（p《0.05）。

2.5赤星病脅迫對抗、感病煙草品種ET釋放量的影響

圖5顯示，正常生長發(fā)育環(huán)境下，2個(gè)品種的ET釋放量呈緩慢上升趨勢。赤星病脅迫造成抗、感病品種的ET釋放量表現(xiàn)出較大的上升幅度。在赤星病脅迫處理0-6d時(shí)，JYH的ET釋放量小幅上升，但與對照差異不顯著;脅迫9、12d時(shí)，JYH的ET釋放量顯著高于對照（p《0.05）。CBH的ET釋放量在脅迫處理612d時(shí)顯著高于對照與JYH（p《0.05），分別是JYH的1.23、15和1.08倍。

2.6赤星病脅迫對抗、感病煙草品種JA含量的影響

如圖6所示，在正常生長條件下，抗、感病品種的JA含量逐漸降低。在赤星病脅迫初期JYH的JA含量增加，在脅迫3d時(shí)顯著高于對照（p《0.05）之后與對照無顯著差異。在脅迫312d，JYH的JA含量始終顯著高于CBH（p《0.05），分別為CBH的1.49、1.46、1.96和2.48倍;而此時(shí)CBH的JA含量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，且顯著低于對照（p《0.05）。

3討論

內(nèi)源激素是植物抵御病原菌侵染的有效防線。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在赤星病脅迫下，凈葉黃、長脖黃的ABA含量和ET釋放量均出現(xiàn)上升，但GA、IAA、CTK則呈降低趨勢;與凈葉黃相比，長脖黃的ABA含量增幅較小，而GA、IAA、CIK與JA含量降幅較大，并且ET釋放量較高。這與鐘麗娟等田、吳俊江等的研究結(jié)果基本一致。本文研究充分表明不同抗性品種所含的內(nèi)源激素在赤星病菌侵染時(shí)出現(xiàn)不同變化，從而對抗病性發(fā)揮作用。周青的研究結(jié)果證實(shí)，植物保衛(wèi)細(xì)胞中的ABA能夠在逆境條件下對外排放，造成氣孔關(guān)閉;同時(shí)促進(jìn)脯氨酸與乙烯的大量合成以維持植株內(nèi)的水分平衡，最終提高植物抗性。ABA不僅能夠促進(jìn)植物的光合作用與光合產(chǎn)物運(yùn)輸，還可以提高根系的吸水速率，有助于向地上部供水。在本研究中，凈葉黃含有的ABA含量在赤星病脅迫3-6d顯著高于長脖黃，可維持葉片細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，保證光合反應(yīng)與光合活動生成物轉(zhuǎn)運(yùn)的正常進(jìn)行，強(qiáng)其抗赤星病能力。但ABA長時(shí)間的過量增加會導(dǎo)致植物葉片加快脫落，造成植株提前老化死亡在赤星病脅迫處理的9～12d，感病品種長脖黃的ABA積累量顯著高于凈葉黃，并且長脖黃的ET釋放量在脅迫612d也明顯大于凈葉黃，導(dǎo)致其開始出現(xiàn)赤星病病癥，從而加快衰老死亡。感病品種在赤星病脅迫后期具有較大的ABA積累量、ET釋放量，顯示出其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致葉片的衰老死亡活動出現(xiàn)大大提前。這與文獻(xiàn)[12-13]的研究結(jié)論基本一致。

長脖黃中的GA含量在赤星病脅迫下表現(xiàn)出先增加再降低的動態(tài)變化趨勢，而凈葉黃的GA含量在脅迫處理下顯著高于對照，顯示出早期的赤星病脅迫有助于不同抗性品種加快合成GA。但伴隨脅迫處理時(shí)間的推移，這類促進(jìn)效應(yīng)在感病品種中明顯降低，其GA調(diào)節(jié)性能受到明顯抑制，而最終表現(xiàn)為患病區(qū)域壞死成病斑。葉黃的GA含量在脅迫612d均顯著高于長脖黃，表明抗病品種卻能夠通過增加GA含量減輕不良影響，保證葉片的正常生長發(fā)育，緩解赤星病脅迫的抑制效應(yīng)。蔡劉體的研究結(jié)果顯示，小麥在感染白粉病初期GA含量迅速上升，之后下降并維持在較高水平，這與本研究結(jié)果相接近。

具有抗萎病特性的榆樹品種能夠在受到侵染后比感病品種更早產(chǎn)生導(dǎo)管侵填體物質(zhì)，這和具有較高含量的IAA從而有助于出現(xiàn)抗病障礙存在緊密聯(lián)系。CTK有利于促進(jìn)物質(zhì)運(yùn)輸，對阻止葉綠體降解、維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、推遲衰老死亡和清除活性氧自由基（ROS）破壞等活動均發(fā)揮明顯的積極影響，其含量出現(xiàn)降低是造成植物葉片的氣孔關(guān)閉、光合活動受抑制的一個(gè)重要因素KOVAC等研究發(fā)現(xiàn)，在受馬鈴薯YNN病毒侵染之后，JA含量表現(xiàn)出瞬時(shí)大量激，最終誘導(dǎo)植物對病毒的抗病能力。在赤星病脅迫環(huán)境中，抗病品種凈葉黃所含的IAA、CTK和JA含量均顯著高于感病品種長脖黃，使其不會因CTK含量快速降低而導(dǎo)致膜脂過氧化水平加劇與衰老死亡活動加速，而較高含量的IAA可易于生成抗病障礙，加之JA含量的上升可增強(qiáng)一系列抗氧化防御酶及與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)相關(guān)的基因表達(dá)，繼而提升ROS清除能力，有助于保持葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整程度，最終提高抗赤星病能力。

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，在赤星病脅迫下，抗病煙草品種中的內(nèi)源激素積極參與對赤星病菌侵染的防御反應(yīng)，ABA和JA幅較大，GA、IAA、CTK下降緩慢，ET釋放量較少，從而能夠保持煙株的代謝平衡和穩(wěn)定性，在一定程度上抑制或者減輕赤星病脅迫的不利影響;但感病品種的ABA含量在赤星病脅迫下的增幅較小，GA、IAA、CTK和JA下降迅速，ET釋放量較高，最終呈現(xiàn)為感病而加快衰老死亡。內(nèi)源激素的含量差異與變化幅度可以反映不同抗性煙草品種抗赤星病能力。

參考文獻(xiàn)

[1]曠永潔，柳浪，嚴(yán)芳，等.水稻與病原物互作中植物激素功能的研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（2）：74-86.

[2]鄒華松，柔偉，吳薇.柑橘潰瘍病抗感病性機(jī)制研究進(jìn)展[J].森林與環(huán)境學(xué)報(bào)，2018，38（2）：234239

[3]徐以華.水稻穗枯病菌的分離及品種內(nèi)源激素與抗病性關(guān)系研究[D]南寧：廣西大學(xué)，2018

[4]鐘麗娟，趙秀香，賈玉才，等.煙草感染馬鈴薯Y病毒脈壞死株系后內(nèi)源激素的變化安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（15）：3724-3725

[5]吳俊江，劉麗君，高明杰，等不同抗性大豆品種（系）接種灰斑病1、7號生理小種后內(nèi)源激素變化規(guī)律的研究[J].大豆科學(xué)2001，20（1）：14-17

[6]童治軍，張誼寒，陳學(xué)軍，等.雪茄煙品種Beinharti000赤星病抗性基因的QTL定位.作物學(xué)報(bào)，2019，45（3）：47482

[7]楊鐵釗.煙草育種學(xué)[M].第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：285

[8]楊暹，陳曉燕.不同氮營養(yǎng)下炭疽病菌侵染對菜心葉片內(nèi)源激素的影啊.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（5）：919923

[9]周青.逆境脅迫下植物積累脫落酸的生理生態(tài)學(xué)意義.農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，1993，14（4）：231-235

[10] PARIDA A K， DAS A B Salt tolerance and salinity effects on plants a reviewj]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2005， 60（3）324-349.

[11]張明生，謝波，談鋒.水分脅迫下甘薯內(nèi)源激素的變化與品種抗旱性的關(guān)系，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（5）：489-501

[12]宋鳳鳴，鄭重.乙烯產(chǎn)生的抑制與氟樂靈誘導(dǎo)棉苗對枯萎病的抗性有關(guān).植物生理學(xué)報(bào)，1998，24（2）：11-118

[13] COOPER W， BOUZAYEN M， HAMILTON A， et al. Use of transgenic plants to study the role of ethylene and polygalacturonase during infection of tomato fruit by Colletotrichum gloeosporioides [J]Plant Pathology， 1998， 47（3）： 308-316

[14]蔡劉體玉米索核苷單克隆抗體的制備及小麥與白粉病互作初期激素作用的分析[D]南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003

[15] OUELLETTE G B， RIOUX D Anatomical and physiological aspects of resistance to dutch elm disease A]/BLANCHETTE R A， BIGGS A R. Defense mechanisms of woody plants against fungi[M]Heidelberg： Springer Heidelberg， 1992： 257-307

[16]汪寶卿，慈敦偉，張禮風(fēng)，等.同化物供應(yīng)和內(nèi)源激素信號對大豆花發(fā)育的調(diào)控.大豆科學(xué)，2010，29（5）：878-882

[17] AHMED S， NAWATA E， SAKURATANI T. Changes of endogenous ABA and ACC， and their correlations to photosynthesis and water relations in mungbean （Vigna radiate （L）Wilczak cv KPS1）during waterlogging[J].Environmental and Experimental Botany，2006，57（3）：278-284.

[8] KOVAC M， MULLERA， JARH D M， et al. Multiple hormone analysis indicated involvement of jasmonate signaling in the early defence of potato to potato virus YNTN[J]. Biologia Plantarum， 200953（1）：195-199.

[19] KUMAR GJ， REDDY A M， NAIK S T， et al. Jasmonic acid induced changes in protein pattern， antioxidative enzyme activities and peroxidase Isozymes In peanut seedlings [J] Biologia Plantarum，2006，50（2）：219-226

[20] SASAKI-SEKIMOTO Y， TAKI N， OBAYASHI T， et al Coordinated activation of metabolic pathways for antioxidants and defence compounds by jasmonates and their roles in stress tolerance in Arabidopsis [J]. Plant Journal， 2005， 44（4）： 653-668