郭鵬誠 楊曉 毛輝 王學波 申展 劉旦 楊愛國 王元英

摘要：為研究NIPHGPX基因?qū)煵菽望}性的影響，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得VIPHGPR基因過表達和CRISPR/Cast9敲除材料，利用150mmol/LNACI對轉(zhuǎn)基因材料處理14d，研究鹽處理下轉(zhuǎn)基因材料根長、GPx酶活性、丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）含量的變化。結(jié)果表明，NIPHGPX基因表達在鹽脅迫3h后即受到誘導(dǎo);鹽處理顯著抑制了野生型煙草根部的生長，提高了丙二醛和過氧化氫的積累;鹽脅迫下過表達株系的根長比野生型更長，MDA和HO2含量較低，而基因敲除材料根的生長則進一步受到抑制，GPx酶活性明顯降低，地上部MDA和H2O2的積累顯著高于野生型。綜上所述，過表達NIPEGPX基因提高了煙草的耐鹽性，而敲除NIPHGPX3基因則減弱了煙草的耐鹽性，推測NIPHGPX基因可能通過影響煙草體內(nèi)活性氧物質(zhì)的清除活性參與植株對鹽害的脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶;耐鹽性;基因功能;煙草

鹽害是影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要非生物脅迫叫，尋找植物耐鹽基因能夠幫我們了解植物耐鹽機理，為耐鹽種質(zhì)資源的發(fā)掘提供參考，也為培育優(yōu)質(zhì)耐鹽品種或改良優(yōu)良品種的耐鹽性提供依據(jù)。鹽脅迫可以改變土壤滲透勢導(dǎo)致植物吸水困難，過量的鹽離子還會對植物產(chǎn)生離子毒害，使植物無法維持體內(nèi)離子平衡2。鹽脅迫對細胞膜破壞巨大，高濃度的Na*和C會影響植物對Ca2+的吸收，細胞膜上的Ca2被Na取代，使細胞膜的選擇透過性變差，營養(yǎng)物質(zhì)外泄，膜脂過氧化程度提高，有害物質(zhì)積累，植物生長發(fā)育受損。鹽脅迫使烤煙葉片葉綠體和線粒體嚴重受損，細胞核液濃度下降，核內(nèi)異染色質(zhì)化明顯，影響烤煙品質(zhì)，與鹽脅迫類似的干旱脅迫造成烤煙葉片活性氧含量增加，葉綠體受到破壞，光合速率降低，植物生長發(fā)育受到抑制。

除滲透脅迫外，鹽害還會造成活性氧物質(zhì)（ROS）在體內(nèi)的積累，對植物產(chǎn)生氧化脅迫。低濃度的ROS作為信號分子調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達，但高濃度的ROS會破壞細胞結(jié)構(gòu)。植物受到氧化脅迫后迅速積累多種抗氧化酶來清除ROS，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶SOD）、過氧化氫酶（CA）、谷胱甘肽還原酶（GR）及抗壞血酸過氧化物酶（APX）等01。茄科植物中GPx研究較少，DEPEGE等發(fā)現(xiàn)機摩擦能誘導(dǎo)番茄GPx的表達，并參與ROS的清除，而ALEIARBY等發(fā)現(xiàn)鹽處理抑制了番茄中GPx的mRNA水平。

相比其他GPx家族成員，PHGPX能特異性清除膜上的磷脂氫過氧化物，對于維持細胞膜的穩(wěn)態(tài)具有重要意義1611。楊曉東等對蘿卜磷脂氫谷甘肽過氧化物酶基因（RSPHGPX）進行研究，發(fā)現(xiàn)其上游調(diào)控序列含有多個響應(yīng)激素、脅迫、光信號的元件，RNA印跡分析發(fā)現(xiàn)RSPHGPX受到脫落酸、連續(xù)光照和冷脅迫的調(diào)控。劉賽等2克隆了茶樹中的CSGPXL基因，其具有PEGPX特有的結(jié)構(gòu)域，過表達CSGPX1使煙草抗旱性得到提升。HERBETTE等2在番茄中過表達家鼠的GPx5基因類似于植物中的PHGPX）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄更能抵抗機械損傷的影響，但易受到生物脅迫。CHEN等2在煙草葉片中瞬時表達番茄LEPHGPX，發(fā)現(xiàn)LEPHGPX可保護煙草葉片免于氧化脅迫和凋亡因子Bax引起的細胞凋亡。

目前有關(guān)煙草NTPHGPX的基因功能還鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽處理下NTPHGPR的表達急劇上升，推測NTPHIGPX能夠參與煙草抵御鹽脅迫的過程，進一步將該基因從煙草中克隆，利用基因過表達及敲除株系研究其在煙草抵抗鹽脅迫響應(yīng)中的作用，為解析NTPHGPX參與煙草響應(yīng)鹽脅迫的分子機制提供科學數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料和處理

試驗于2020年在山東青島中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所進行，試驗材料為煙草品種凈葉黃，由中國煙草種質(zhì)資源庫提供。為了研究NTPEGPX是否受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，將煙草種子播于營養(yǎng)土，待苗長至4片真葉時，洗去根部雜土，置于150mmol/LNaC溶液處理0、1、3、6、12和24h，取幼苗真葉的最上部完全展開葉用于分析NTPHGPX基因在鹽脅迫下的表達模式，每個處理取3次重復(fù)，每個重復(fù)取3棵煙株混樣，液氮研磨提取RNA。正常條件下生長至4片真葉時，分別取煙草根、莖、葉等部位的組織，每個處理取3次重復(fù)，每個重復(fù)取3棵煙株混樣，液氮研磨提取RNA，用于分析NTPHGPR基因表達的組織特異性。煙草植株在25℃、光周期為16h光照8h黑暗的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。

為了研究轉(zhuǎn)基因材料耐鹽性是否發(fā)生改變，將煙草種子經(jīng)消毒后播于MS培養(yǎng)基，瓊脂濃度08%，發(fā)芽后選取生長一致的幼苗分為兩組，一組移至MS培養(yǎng)基中，另一組移至含有150mmo/LNACI的MS培養(yǎng)基，生長14d后測量根長，每個處理4次重復(fù)，取地上部分用于測定GPx酶活性、MDA和H2O2含量等生理生化指標，每個處理3次重復(fù)。

1.2NTPEGPX基因克隆、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因材料的獲得

參考茄科基因組網(wǎng)站（https：//solgenomics.net上收錄的煙草品種K326基因組信息，從K326的DNA中分離克隆磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（序列號：mRNA_136682），命名為NtPHGPX，利用ln-FusionHDCloningKit（Takara公司）將克隆到的基因連接于用ECORI和SalI雙酶切后的表達載體PRI-eGFP，參照XING等2的方法，使用載體pKSE401構(gòu)建NTPHGPX基因敲除載體，將T-PHGPX-F和T-PHGPX-R稀釋成50umol/L，加入5×DNA寡核苷酸退火緩沖液（碧云天生物技術(shù)公司）退火形成雙鏈DNA，使用BsaI（NEB公司單酶切pKSE401載體，回收酶切產(chǎn)物，利用T4連接酶將靶位點連接到酶切后的pKSE401載體上。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5，陽性克隆進行菌落PCR及測序驗證，提取質(zhì)粒采用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)杄菌感受態(tài)細胞EHA105。采用葉盤法轉(zhuǎn)化凈葉黃品種，獲得過表達T2代株系及基因敲除位點純合突變體。在靶位點上下游設(shè)計引物，PCR擴增靶位點附近序列，將序列與野生型進行比對，靶位點比對無差異說明未編輯，靶位點是雙峰說明是編輯雜合狀態(tài)，靶位點純合且有差異表明成功編輯且編輯位點純合。本試驗所采用的引物見表1。

1.3構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

在美國國家信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索，下載擬南芥（arabidopsis thaliana）中已知的GPx蛋白序列，分別為ATGPX1（NP180080.1）、ATGPX2（NP_194915.2）、ATGPX3（NP001189742.1）、ATGPX4（NP_566128.1）ATGPX5（NP191867.1）、ATGPX6（NP192897.2）、ATGPX7（NP_194915.2）、ATGPX8（NP564813.1）、ATPEGPX（OAO9876），馬鈴薯（Solanum tuberosum）中STPHGPX（XP0151687441）栽培番茄（Solanumlycopersicon）中SIPEGPX（XP_004245287.1）、野生番茄（Solanum pennellii）中SPPHGPX（XP_0150846271）、辣椒（Capsicum annuum）中CAPIGPX（XP_016554525.1）;使用MEGA5.0軟件對蛋白序列進行多序列比對，并用鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4實時熒光定量PCR

取100mg樣品，加入液氮研磨勻漿，使用Trizol法提取植物RNA，用Hiscriptr II Q RT SupermixforQPCR（諾唯贊）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用Lightcycle96型熒光定量PCR儀（Roche公司）進行qRT-PCR，配置20L反應(yīng)體系，其中2Chamq SYBRColor QPCR MasterMix（諾唯贊）10uL、dIHO7.2uL，cDNA2uL、上游引物（10 umoL）和下游引物（10 umol/L）分別0.4uL，NIPHGPR基因表達量檢測引物和煙草內(nèi)參基因p-actin檢測引物序列見表1PCR反應(yīng)程序為：95℃30s;95℃10s，60℃30s，40個循環(huán);95℃10，65℃60s，97℃1s。每個反應(yīng)3次重復(fù)。通過實時熒光定量PCR分析不同組織、鹽脅迫下以及過表達株系葉片中NTPHGPX基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.5生理生化指標測定

使用丙二醛（MDA）測試盒、過氧化氫（H2O2）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）測試盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），按照說明書進行測定。采用硫代巴比妥酸比色法測定樣品丙二醛含量2，采用硫酸鈦比色法測定過氧化氫含量。GPx酶活性通過比色法測定NADPE的減少量確定。

1.6數(shù)據(jù)分析

使用SPSS21.0進行數(shù)據(jù)的顯著性分析，采用LSD法進行多重比較，采用5%的統(tǒng)計檢驗標準使用GraphpadPrism8.0繪制圖表。

2結(jié)果

2.1NTPHIGPX基因克隆和進化樹分析

參考茄科基因組網(wǎng)站上序列信息設(shè)計引物，從煙草品種K326的cDNA中進行克隆，電泳結(jié)果（圖1）顯示克隆出的片段大小約為585bp，與預(yù)期結(jié)果一致。序列比對結(jié)果表明，該序列與參考序列完全一致，將其命名為NTPHGPX。該片段編碼195個氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子量21.7kDa，等電點位971。系統(tǒng)發(fā)生樹和序列分析結(jié)果表明，VTPHGPR中含有GPx家族的保守結(jié)構(gòu)域，其與馬鈴薯中預(yù)測為PHGPX蛋白的序列親緣關(guān)系最近，其次為番茄中PHGPX，但與擬南芥中已知的GPx蛋白和PHGPX蛋白親緣關(guān)系較遠，并非同源基因（圖2A，B）。

2.2NTPHIGPX基因受到鹽脅迫誘導(dǎo)

圖3A結(jié)果表明，NTPHIGPX基因在根莖葉中都有表達，且在葉中表達量顯著高于根和莖中，表達量分別為后兩者的1.66倍和1.74倍。圖3B結(jié)果表明，NtPEGPX基因表達量明顯受到NaC溶液處理的誘導(dǎo)，在處理3h后其表達量比處理前升高了120.01%;而鹽處理24h后，其表達量則大幅升高了4倍左右。該試驗結(jié)果表明NTPHIGPR基因可能在煙草對鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。

2.3NIPHGPX過表達促進煙草在鹽脅迫下根的生長

利用NTPEIGPX過表達T2代株系OX-1

（Overexpression line1），OX-2（overexpression line2）及基因敲除純合株系Ci進行表型鑒定。兩個過表達株系OX-1、OX-2的表達量分別為野生型的7.21倍和5.52倍（圖4A）。對CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯材料的突變位點進行PCR擴增，結(jié)果顯示基因敲除純合株系Ci在靶位點插入一個堿基G，造成編碼氨基酸發(fā)生移碼，導(dǎo)致肽鏈提前終止（圖4B）。

將野生型及轉(zhuǎn)基因材料分別在正常條件和NaCl脅迫下處理（圖4C，D），在不加NaC的MS培養(yǎng)基上，野生型煙草、過表達株系OX-1、OX-2、基因敲除株系Cri之間根長無顯著差異;在含有150mmol/LNacl的MS培養(yǎng)基上，野生型煙草根的生長受到明顯抑制，比正常條件下的野生型植株根長減少28.16%，而兩個過表達株系根的生長未受到抑制;基因敲除株系Ci在NaCl脅迫下根長更短，相比正常MS培養(yǎng)基上的C株系減少了46.00%。上述結(jié)果表明，過表達NTPEGPX能夠增強煙草對鹽脅迫的耐性。

2.4NTPHGPX過表達對鹽脅迫下煙草葉片中GPx酶活性、H2O2和MDA的影響

圖5結(jié)果顯示，正常條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因材料葉片中GPx酶活性無顯著差異，NaC處理誘導(dǎo)野生型植株葉片中GP酶活性顯著提高，酶活性比正常條件下升高約69.68%;NaC處理同樣導(dǎo)致過表達和基因敲除株系中GPx酶活性升高，但在基因敲除株系C中，GPx酶活性升高的幅度較低，顯著低于野生型WT和過表達株系OX-2。

正常條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因材料體內(nèi)H2O2含量無顯著差異，而鹽脅迫下野生型植株葉片內(nèi)H2O2含量大幅增加了70.74%，過表達材料葉片內(nèi)H2O2含量也表現(xiàn)為上升的趨勢，但HO2含量顯著低于野生型對照，并與正常條件下野生型沒有顯著差異，這表明過表達NTPHIGPX基因?qū)η宄}脅迫下H2O2的積累具有一定的作用;基因敲除株系Cri中H2O2積累顯著高于其他材料，相比正常條件下的增加了114.139%（圖6A）。正常條件下，野生型與過表達材料間MDA含量差異不顯著，但基因敲除株系Cn的MDA含量顯著高于野生型。鹽脅迫下，野生型植株葉片內(nèi)MDA含量明顯上升，增幅16.20%;過表達材料MDA含量無明顯上升，而基因敲除材料MDA含量增幅較大，加了19、54%，且MDA含量顯著高于野生型和過表達材料（圖6B）。試驗結(jié)果表明，在鹽脅迫下煙草需要NTPHGPX基因清除過氧化物，維持細胞膜的氧化還原平衡。

3討論

磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（PHGPX）是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，在動植物中均有存在。研究表明PHGPX能特異性地還原氧化的磷脂和脂肪酸，而磷脂是細胞膜的重要組成成分，因此PIGPX對修復(fù)細胞膜的氧化損傷具有重要作用2。本研究克隆了一個煙草中的NtPHGPX基因，發(fā)現(xiàn)其具有GPx家族的保守結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)其與茄科代表作物馬鈴薯、番茄等中的PIGPX親緣關(guān)系較近，而與擬南芥中已知的GPx家族關(guān)系較遠（圖2），表明NTPHGPR可能是擬南芥中所不具有的一類GPx基因，其功能值得進一步研究。有研究表明植物中PHGPX表達量受到多種脅迫反應(yīng)誘導(dǎo)。WANG等28發(fā)現(xiàn)在鹽生植物鹽爪爪（Kalidium foliatum）中PHGPX基因在不同濃度NaCl處理后表達水平顯著增加;LI等2從水稻中分離到一個PHGPX基因，在H1O2和A處理后表達明顯提高;SUGMOTO等在擬南芥中克隆到個可能的PEGPX基因，在NaC和AFe處理后表達量同樣受到誘導(dǎo)。與上述研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)在煙草中NTPHGPX在鹽脅迫的誘導(dǎo)下表達量明顯提高（圖3B），說明PHGPX可能參與植物對不同逆境脅迫的響應(yīng)。進一步研究表明，過表達NTPHGPR能夠促進煙草幼苗在鹽脅迫培養(yǎng)基上根的生長，而NTPHGPX敲除株系根的生長則對鹽脅迫更敏感（圖4C，D），這暗示了NTPHGPR可能在煙草抵御鹽脅迫中起正向調(diào)控作用。

植物在遭受逆境脅迫時往往會產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，過量的活性氧會破壞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性，對細胞造成損害。植物能夠通過包括GPx在內(nèi)的多種酶促反應(yīng)系統(tǒng)清除體內(nèi)過量的活性氧，維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。作為GPx家族成員，PHGPX對逆境脅迫的影響可能與其活性氧物質(zhì)清除能力相關(guān)。本研究中總GPx酶活性在過表達株系與野生型材料中均受到鹽脅迫的顯著誘導(dǎo)，但二者之間沒有顯著性差異（圖5），這可能是由于煙草體內(nèi)含有多種GPx同工酶，過表達一種VTPHGPX對煙草體內(nèi)GPx酶總活性的影響有限。更為重要的是鹽脅迫下敲除株系中GPx酶活性顯著低于野生型，與之相對應(yīng)的，鹽脅迫處理下NTPHIGPX基因敲除株系中H2O2和MDA的含量則顯著高于野生型（圖6）。與本研究結(jié)果類似，胡楊中PEGPX基因過表達后在鹽脅迫培養(yǎng)基上也表現(xiàn)為根長更長且GPx酶活顯著高于野生型，這表明NTPHGPX在鹽脅迫下植物清除活性氧物質(zhì)的過程中起到重要的作用。與此同時，還有研究表明水稻中OSPHGPR過表達可提高水稻抵御百草枯氧化傷害的能力3，茶樹中CSGPX1（屬于PHGPX）基因的過表達可提高體內(nèi)GPx酶活性，從而增加茶樹的耐旱性2，而原核表達蘿卜RSPHGPX和谷胱甘肽共同作用可以減少小鼠NH3T3細胞氧化損傷3，這些研究表明PHGPX可能與植物抵御鹽害、干旱、除草劑等逆境引起的氧化脅迫均有關(guān)，但其參與的鹽脅迫響應(yīng)途徑是如何被上游基因調(diào)控等科學問題仍需更加深入的研究。

4結(jié)論

本研究首次從煙草中克隆了一個磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因NTPEGPX，發(fā)現(xiàn)其表達受鹽脅迫誘導(dǎo)。在鹽脅迫下，煙草NTPEGPX過表達株系根長顯著長于野生型，MDA和H2O2積累較野生型低;而敲除株系根長顯著短于野生型，MDA和H2O積累較野生型顯著升高。研究結(jié)果表明，NIPEGPX可能通過清除活性氧積累造成的過量脂質(zhì)過氧化物，從而維持植物體內(nèi)膜的氧化還原平衡，進而增強煙草的耐鹽性。本研究初步揭示了NTPHGPX的耐鹽功能，為培育和改良優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)耐鹽煙草新品種提供一定理論基礎(chǔ)，但其參與的鹽脅迫響應(yīng)途徑是如何被上游基因調(diào)控等仍需更加深入的研究。

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