鄭元仙 楊敏 王繼明 許銀蓮 蔡憲杰 黃飛燕 童文杰 陳小龍 余磊 何元?jiǎng)?/p>

摘要：為從微生物生態(tài)學(xué)角度探求烤煙根腐病的發(fā)生原因并為其防控提供理論依據(jù)，利用Illumina Miseq高通量測(cè)序分析了煙草根腐病發(fā)病和健康植株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的差異，結(jié)果表明，烤煙根腐病發(fā)生對(duì)烤煙根際士壤真菌的豐富度有顯著影響，其中健康和患病煙株根際土壤樣品中真菌OTU數(shù)分別為904個(gè)和647個(gè)，健康煙株真菌OTU總數(shù)為患病煙株的40倍，特有OTUs數(shù)是患病煙株的2.59倍;患病煙株根際土壤真菌群落多樣性水平顯著低于健康煙株土壤，患病煙株根際土壤的Shannon、ACE和Chaol指數(shù)分別較健康植株降低了29.81%6、40.12%6和40.61%;同時(shí)，患病煙株與健康煙株根際土壤真菌群落的優(yōu)勢(shì)物種顯著不同，患病煙株根際土壤中烤煙根腐病病原菌茄鐮刀菌（F.solani）相對(duì)豐度較健康煙株根際土壤增加了303.45%，為健康煙株的4.03倍，且棘孢木霉（7 ichoderma asperella）和青霉菌（Penicillium raper）的相對(duì)豐度亦較健康煙株分別增加了17.62%和50.46%。煙草植株根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)改變及物種多樣性降低是烤煙根腐病發(fā)生的重要特征。研究可為該病害的早期預(yù)防或生態(tài)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：烤煙;根腐病;根際生物;群落結(jié)構(gòu);多樣性

煙草是云南重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。由鐮刀菌屬（Fusarium spp）真菌侵染引起的烤煙根腐病是云南臨滄等植煙區(qū)重要土傳病害之一，發(fā)病煙株葉片變黃，莖稈變黑，維管束常變黑壞死，根系腐爛，嚴(yán)重時(shí)煙株常整株枯死山。該病在臨滄部分植煙區(qū)發(fā)病率為15.5%～56.3%，嚴(yán)重影響了煙葉的產(chǎn)量與質(zhì)量。目前生產(chǎn)中尚無(wú)有效的防治根腐病方法。因此，尋求該病害早期預(yù)防或生態(tài)調(diào)控措施尤為迫切。

土壤是作物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，同時(shí)也是土傳病原物和各類土壤微生物棲息的重要場(chǎng)所。根際土壤微生物與土傳病原物同時(shí)生長(zhǎng)在一個(gè)環(huán)境中，二者互作會(huì)對(duì)植物病害的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生直接或間接影響。大量研究表明，土壤微生物的數(shù)量和活性與土傳病害的發(fā)生存在一定聯(lián)系，在微生物多樣性豐富的土壤中病原菌較難生存，而土傳病害的發(fā)生也會(huì)導(dǎo)致土壤微生物的多樣性降低。研究表明，健康植株與患病植株根際微生物在數(shù)量上存在一定差異。同時(shí)，根際微生物與植物抗病性也有著密切的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)可以很好地防治煙草青枯病的發(fā)生，黃瓜根際土壤的某些真菌對(duì)黃瓜土傳病害有防治作用。由此可見(jiàn)，了解病原菌與根際其他微生物的功能及二者互作關(guān)系對(duì)土傳病害的防治具有重要意義。

根際微生物組成復(fù)雜、活性高，常被稱為植物的第二基因組，而高通量測(cè)序技術(shù)具有獲得的信息量大、樣品間平行性好等優(yōu)點(diǎn)，可快速、準(zhǔn)確、全面地探究樣品中微生物的群落種類、數(shù)量，獲取更加豐富的微生物多樣性信息。因此，本研究采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)分析健康煙株與患烤煙根腐病煙株根際土壤真菌群落多樣性的差異，旨在從微生物生態(tài)學(xué)角度分析烤煙根腐病的發(fā)生原因，并為該病害的有效預(yù)防或生態(tài)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地點(diǎn)

供試土壤樣品于2018年7月采集于云南省臨滄市耿馬縣勐撒鎮(zhèn)烤煙植煙區(qū)（99°232”E，23°3340N），試驗(yàn)區(qū)植煙土壤類型為紅壤，土壤質(zhì)地為輕黏土，供試烤煙品種為云煙87，試驗(yàn)區(qū)施肥及其他田間管理措施一致，均參照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)管理辦法執(zhí)行。

1.2土樣采集

選取烤煙根腐病典型發(fā)病煙田，在同一地塊中（自然條件及土壤性質(zhì)相似）選取具烤煙根腐病典型癥狀的煙株和健康煙株各3株，收集附著在根上04mm的土壤作為根際土，分別命名為Pathogen（發(fā)病土）和Health（健康土），去除土樣中的雜物、細(xì)根后放入自封袋中（各煙株根際土樣單獨(dú)保存），立即置于液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3土壤真菌多樣性的測(cè)定

1.3.1基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增參照FASTDNARSPINKitforSoil（MP，USA）土壤基因組DNA提取試劑盒的步驟提取各根際壤樣品DNA，DNA濃度和純度利用Nanodrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。使用弓ITS1F（5'ACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）/ITS2R（5'-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）對(duì)18SIRNA基因的ITS-1可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45，36個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。擴(kuò)增體系為20uL：4uL5×Fastpfu緩沖液;2uL2.5mmol/LDNTPS;0.8uLForwardPrimer（5umol/L）;0.8HLReversePrimer（5umol/L）;0.4ulFastpfu：聚合酶;02HLBSA10ngDNA模板;加dHO至20uL。使用2%6瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyprepDNAGelExtractionKit（Axygen，USA）試劑盒進(jìn)一步純化回收后，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Mise測(cè)序。

1.3.2數(shù)據(jù)的質(zhì)控與分析原始測(cè)序序列使用Irimmomatic軟件質(zhì)控，用FLASH軟件進(jìn)行序列拼接;通過(guò)Search軟件（Version7.0）過(guò)濾并去除嵌合體序列得到有效序列;用Uparsell軟件（Version7.1）在97%的相似性水平上劃分操作分類單元;代表序列用RDPclassifier軟件剛和SIVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，利用Mothur軟件（versionV.1.30.1作稀釋度曲線，計(jì)算文庫(kù)覆蓋率Coverage）、Shannon、Simpson、ACE及Chaol指數(shù)，對(duì)物種的多樣性和豐富度指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià);利用Qime軟件（Version1.7.0）建立的Bray-Curtis距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCOA）。

2結(jié)果

2.1真菌的OTU豐度和Alpha多樣性

在97%相似水平上土壤樣品真菌群落OTU豐度和多樣性指數(shù)如表1所示，香農(nóng)指數(shù)稀釋度曲線顯示（圖1），隨著測(cè)序數(shù)量的上升，稀釋度曲線斜率逐漸下降，趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量足夠。覆蓋率（Coverage）是指樣本中序列被檢測(cè)出的概率，其值越高，代表本次測(cè)序結(jié)果越符合樣本中微生物的實(shí)際情況，在本試驗(yàn)中，2個(gè)處理的覆蓋率分別為9%和99.91%（表1），表明測(cè)序讀長(zhǎng)足以進(jìn)行此項(xiàng)分析。

患病和健康煙株根際土壤樣品中真菌的OTU豐度分別為647個(gè)和904個(gè)，健康煙株根際土壤的真菌OTU豐度是患病煙株的1.40倍（表1）。真菌OTUs分布韋恩圖表明，兩個(gè)處理根際土壤中一共有1551個(gè)OUs（圖2），共有的OTUs為485個(gè)，只占總數(shù)的31.27%，健康煙株根際土壤所特有的OUs數(shù)是患病煙株的2.59倍，說(shuō)明病害的發(fā)生明顯降低真菌OTU豐度。此外，病害的發(fā)生對(duì)烤煙根際土壤真菌的豐富度和多樣性均有顯著影響?；疾熤旮H土壤的Shannon指數(shù)較健康煙株降低了29.81%，Simpson指數(shù)升高了69，23%，說(shuō)明患病煙株根際士壤真菌群落多樣性水平低于健康煙株土壤（Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，群落多樣性越高）。除群落多樣性外，病害的發(fā)生還會(huì)造成烤煙根際土壤真菌群落的豐富度顯著降低，患病煙株根際壤的ACE和Chao1指數(shù)較健康煙株分別降低了40.12%和40.61%6，差異均達(dá)顯著水平（p《0.05）。

2.2真菌的群落種類組成及相對(duì)豐度

各處理根際土壤樣品中真菌在門（Phylum）分類水平上物種相對(duì)豐度堆積柱形圖如圖3所示。由圖3可知，不同處理煙株根際土壤真菌區(qū)系在門水平上主要由子囊菌門（Ascomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）組成，二者均占各處理總量的90%以上。但患病煙株根際土壤中子囊菌門相對(duì)豐度較健康煙株增加了4.23%，而被孢霉門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度卻較健康煙株分別減少了12%和45.42%。

由圖4可知，患病煙株根際土壤真菌區(qū)系在屬水平上主要由木霉屬（Trichoderma，36.97%）、鐮刀菌屬（Fusarium，28.50%）、被孢霉屬（Mortierella，6.48%）和青霉屬（Penicillium，5.13%）組成，四者約占總量的77.08%;而健康煙株根際土壤真菌在屬水平上則主要由木霉屬（33.12%）、鐮刀菌屬（14.37%）、被孢霉屬（8.14%）、青霉屬（3.33%）、unclassified k Fungi（3.78%），unclassified pAscomycota（4.73%）和枝頂孢霉屬（Acremonium3.37%）組成，七者約占總量的70.84%。病害對(duì)烤煙根際土壤真菌群落的相對(duì)豐度影響較大，易造成某些優(yōu)勢(shì)菌群的大量繁殖，患病煙株根際士壤中木霉屬、鐮刀菌屬和青霉菌屬的相對(duì)豐度分別是健康煙株根際土壤的1.12、1.98和1.54倍。說(shuō)明病害的發(fā)生對(duì)烤煙根際土壤真菌群落分布具有一定影響，可造成部分真菌屬水平上的比例失衡。

從種的分類水平看（圖5），木霉屬真菌主要分布于棘孢木霉（L.asperella），鐮刀菌屬真菌主要分布于茄鐮刀菌（Fsolani）和unclassified Fusariun，青霉屬真菌主要分布于青霉菌（Praper）患病煙株根際士壤中棘孢木霉（35.65%）和茄鐮刀菌（18.72%）相對(duì)豐度之和為54.37%，而健康煙株根際土壤中二者相對(duì)豐度分別為30.31%和464%，僅占總量的3495%。烤煙根腐病病菌茄鐮刀菌（solani）在患病煙株根際士壤中積累明顯，相對(duì)豐度較健康煙株根際土壤增加了303.45%，約為健康煙株的4.03倍。同時(shí)，患病煙株根際土壤中棘孢木霉和青霉菌的相對(duì)豐度亦較健康煙株增加了17.62%和50.46%?？傮w看來(lái)，病害對(duì)烤煙根際土壤的真菌群落組成及相對(duì)豐度均有顯著影響。

2.3真菌群落組成的PCoA聚類分析

PcoA主成分分析表明（圖6），主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對(duì)樣品差異性的解釋度分別為43.14%6和27.05%，兩者總計(jì)可解釋全部壤樣品的70.19%?？傮w看來(lái)，患病煙株根際土壤真菌群落（Pathogen）主要分布在PC2的正值區(qū)域，而健康煙株根際土壤真菌群落（Health）主要分布在PC2的負(fù)值區(qū)域，進(jìn)一步說(shuō)明患病煙株與健康煙株根際土壤真菌物種組成存在明顯差異。

3討論

土壤微生物是土壤中最活躍的生物體，對(duì)土壤環(huán)境變化敏感，在一定程度上反應(yīng)著土壤質(zhì)量和生態(tài)功能的變化，土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是評(píng)判土壤生態(tài)系統(tǒng)健康的重要指標(biāo)。土傳病害的病原菌棲息于壤中，難以根除，病原菌與植物根際微生物生長(zhǎng)在同一個(gè)環(huán)境中，病原菌與根際其他微生物類群之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生態(tài)位等有限資源的竟?fàn)幊Ｔ斐筛魑⑸锶郝浞植急壤Ш?。從生態(tài)學(xué)角度開展土傳病害發(fā)生與根際土壤微生物多樣性關(guān)系的研究表明，土壤微生物多樣性的喪失易導(dǎo)致植物土傳病害增加22，而高微生物多樣性和活性有利于促進(jìn)植物生長(zhǎng)23-2，增強(qiáng)植物自身抗性并抑制土傳病害的發(fā)生。本研究中患烤煙根腐病煙株根際壤Shannon、ACE和Chaol指數(shù)分別較健康植株降低了29.81%、40.12%和40.61%;烤煙根腐病病原菌茄病鐮刀菌（E solani）在患病煙株根際土壤真菌群落中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度為健康煙株的4.03倍，顯示根際土壤中病原菌大量繁殖、真菌群落多樣性和豐富度明顯降低是烤煙患根腐病的重要特征。這與罹病玉米植株根際真菌區(qū)系中病原菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他種真菌很少，根系微群落已轉(zhuǎn)化為病理組合的研究結(jié)論相似?？傮w看來(lái)，植物根際士壤微生物群落是一個(gè)綜合體，病害的發(fā)生與群落結(jié)構(gòu)失衡密切相關(guān)。

研究指出，植物抗病性除與其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化代謝有關(guān)外，還與根際微生物有著密切關(guān)系，植物根際中可能存在著大量的拮抗微生物。本研究中，患病煙株根際土壤中茄病鐮刀菌（Fsolan）顯著增加的同時(shí)，棘孢木霉（T：asperellum）和青霉菌（PTaper）的相對(duì)豐度亦較健康煙株也有不同程度增加，二者增量分別為17.62%和50.46%，木霉屬（Trichodermaspp）真菌具有解磷、解鉀和固氮等作用，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生和誘導(dǎo)宿主抗性等作用抑制病原體，是一類重要的生防真菌2青霉屬（Penicilliumspp）真菌可參與有機(jī)物的分解，促進(jìn)C、N、P等多種元素的循環(huán)，還能產(chǎn)生多種重要的活性代謝產(chǎn)物，降解多種環(huán)境有害物質(zhì)2相關(guān)研究表明，該類真菌均可對(duì)部分鐮刀菌屬（Fusariumspp）表現(xiàn)出明顯抑制作用28-2。這可能是植物病原菌侵染時(shí)為抵制病害發(fā)生，而引起的植物自身抗性或其根際生態(tài)系統(tǒng)抗性響應(yīng)的結(jié)果，但這兩種微生物對(duì)茄病鐮刀菌（F.solani）是否存在明顯的拮抗作用以及其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本研究表明，煙草植株根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)改變及物種多樣性和豐富度降低是烤煙根腐病發(fā)生的重要特征，煙株根際生態(tài)系統(tǒng)失衡可能是促進(jìn)病原菌大量繁殖并進(jìn)一步加重病害發(fā)生的原因。因此，通過(guò)采取有效措施重塑穩(wěn)定和更多樣化的根際微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提升煙株根際生態(tài)抗性來(lái)預(yù)防或減輕土傳病原菌的危害可作為烤煙根腐病的防控途徑之一。此外，健康煙株根際微生物中拮抗微生物篩選，以及各種微生物尤其是優(yōu)勢(shì)菌種與病原菌及其他有益微生物之間的相互關(guān)系的進(jìn)一步研究，也將為有效利用植物生態(tài)調(diào)控措施防治烤煙根腐病提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

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