劉德浩，陳智濤，鄧仿東，王少東，舒夏竺，黃競中，廖文莉

（惠州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東惠州 516001）

苦郎樹（Clerodendrum inerme）為馬鞭草科（Verbenaceae）大青屬攀援狀灌木，直立或平臥，高可達2 m，自然分布于熱帶和亞熱帶的海岸、河灘和潮汐地，在園林綠化中是很有價值的地被植物或樹籬植物，也是沿海防護林的優(yōu)良樹種[1-4]。苦郎樹的枝和葉入藥可用于治療跌打損傷、血瘀腫痛、瘡癬疥癩和濕疹瘙癢等，根部能分離出具有鎮(zhèn)痛和抗菌作用的糖酐酯[5-7]；也是一種常用的苦味補藥。其臨水生長，種子收集困難。本研究對苦郎樹的莖段組織培養(yǎng)技術(shù)開展研究，以期建立苦郎樹完整的離體快繁技術(shù)體系，為其規(guī)?；缣峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于惠州市惠東縣鐵涌鎮(zhèn)野外收集的3年生苦郎樹種子實生苗，選取當(dāng)年新抽出的半木質(zhì)化枝條作為外植體材料[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌

選取生長健壯且長勢良好的苦郎樹實生苗枝條，去除葉片后帶回實驗室進行預(yù)處理。首先將選取的苦郎樹枝條修剪成10 cm長的莖段，放在流水下沖洗2 h，然后放入超聲波清洗機中用0.2%滅菌凈清洗20 min，最后用無菌水沖洗5 次，備用。在超凈工作臺上，以75%酒精和0.1%氯化汞HgCl2作為消毒劑進行不同消毒處理，之后用無菌水沖洗5次，將滅菌后的外植體接種至MS培養(yǎng)基中。共12個處理，每處理接種10 個莖段，3 次重復(fù)。接種20 天后統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率。

1.2.2 基本培養(yǎng)基的篩選

在合適的滅菌處理基礎(chǔ)上，將滅菌后的苦郎樹莖段分別接種至MS、1/2 MS 和1/4 MS 培養(yǎng)基中，每5天統(tǒng)計1次外植體褐化率，篩選出適宜外植體生長的基本培養(yǎng)基。

1.2.3 初代培養(yǎng)

在基本培養(yǎng)基上，進行不同濃度6-BA（0.5、1.0和1.5 mg/L）、NAA（0.05、0.10 和0.15 mg/L）和IBA（0.5、1.0和1.5 mg/L）的正交試驗，探究不同類型和濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對苦郎樹叢生芽誘導(dǎo)的影響。共9個處理，每處理10瓶，每瓶接種3個莖段。

1.2.4 繼代培養(yǎng)

在1/2 MS 培養(yǎng)基上，進行不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5 和2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10和0.15 mg/L）的激素處理。共12個處理，每處理10瓶，每瓶接種3個莖段。接種30天后統(tǒng)計增殖倍數(shù)，并觀察生長情況。

1.2.5 生根培養(yǎng)

切取生長健壯的芽苗接種至生根培養(yǎng)基中。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0、0.05、0.10、0.15 和0.20 mg/L）。共5 個處理，每處理10 瓶，每瓶接種3個芽苗。接種30天后統(tǒng)計生根情況。

1.2.6 培養(yǎng)條件

初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基均附加25 g/L 蔗糖和6 g/L 瓊脂粉，并調(diào)節(jié)pH 值為5.8。培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為每天12 h。

1.2.7 煉苗與移栽

完成生根培養(yǎng)后，選取生長健壯的生根植株，在蔭棚內(nèi)煉苗10 天。洗凈幼苗根部的培養(yǎng)基后移栽至預(yù)先進行了消毒處理的珍珠巖、泥炭土和沙子（2∶2∶1）混合基質(zhì)中。30天后統(tǒng)計幼苗成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

污染率=（污染數(shù)/接種數(shù)）×100%

萌發(fā)率=（產(chǎn)生愈傷組織數(shù)/接種數(shù)）×100%

誘導(dǎo)率=（未污染外植體產(chǎn)生愈傷組織數(shù)/未污染外植體總數(shù)）×100%

采用Excel 2007 和SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncan，s 新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對外植體滅菌效果的影響

隨著75%酒精和0.1% HgCl2處理時間的增加，苦郎樹外植體污染率逐漸下降（表1）。酒精處理30 和60 s 的外植體污染率均顯著低于未經(jīng)酒精處理的外植體（P＜0.05），0.1% HgCl2處理7 min 的平均萌發(fā)率最高。最佳滅菌方式為處理6（75%酒精處 理30 s 和0.1% HgCl2處 理7 min），污染率為16.67%，萌發(fā)率為73.33%。

表1 不同消毒處理對苦郎樹外植體的影響Tab.1 Effects of different disinfection treatments on explants of C.inerme

2.2 基本培養(yǎng)基的篩選

1/2 MS 培養(yǎng)基中外植體的褐化率明顯低于MS和1/4 MS 培養(yǎng)基，對愈傷組織的誘導(dǎo)率（76.67%）顯著高于其他兩種培養(yǎng)基（P＜0.05）（表2）。將外植體接種至1/2 MS 培養(yǎng)基的第12 天能觀察到側(cè)芽萌發(fā)。因此，選用1/2 MS 培養(yǎng)基作為外植體側(cè)芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。

表2 基本培養(yǎng)基的篩選Tab.2 Screening of basic medium

2.3 初代培養(yǎng)

以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，進行不同濃度6-AB、NAA 和IBA 處理（表3）。結(jié)果表明，處理6 的平均叢生芽數(shù)為3.52 個，平均芽長為2.12 cm，平均葉片數(shù)為5.26 片，誘導(dǎo)率為90.00%，所有指標均表現(xiàn)最好。因此，選擇處理6 為苦郎樹適宜的初代培養(yǎng)基，即1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

表3 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對苦郎樹外植體叢生芽形成的影響Tab.3 Effects of growth regulators on cluster bud formation in explants of C.inerme

2.4 繼代培養(yǎng)

將初代誘導(dǎo)出的叢芽接種到增殖培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-BA 和NAA 進行繼代培養(yǎng)。結(jié)果表明，12 個處理的增殖倍數(shù)為2.9 ～4.2（表4）。處理8的增殖倍數(shù)最高（4.2），繼代培養(yǎng)出的小芽生長健壯且莖粗壯。因此，選擇處理8為苦郎樹適宜的繼代培養(yǎng)基，即1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

表4 不同激素處理對苦郎樹萌芽增殖的影響Tab.4 Effects of different hormone treatments on multiplication of C.inerme

續(xù)表4 Continued

2.5 生根培養(yǎng)

隨著NAA 濃度的增加，苦郎樹小芽的生根率呈先增加后下降的趨勢（表5）。處理3 的平均根數(shù)最多，平均生根率最高。其他處理均不適宜煉苗移栽。因此，選擇處理3為苦郎樹適宜的生根培養(yǎng)基，即1/2 MS+0.10 mg/L NAA，平均根數(shù)為3.50條，平均生根率為93.33%，且根系粗壯。

表5 不同激素處理對苦郎樹生根的影響Tab.5 Effects of different hormone treatments on rooting of C.inerme

2.6 煉苗與移栽

選擇生長健壯、根系發(fā)達且粗壯的植株置于蔭棚內(nèi)煉苗，逐步打開瓶蓋，在瓶苗逐漸適應(yīng)外界生長環(huán)境后，移栽至預(yù)先進行了消毒處理的珍珠巖、泥炭土和沙子（2∶2∶1）混合基質(zhì)中（圖1G）。30 天后的移栽成活率為100%，且植株生長良好，須根數(shù)量有所增加。

圖1 苦郎樹組織培養(yǎng)與移栽Fig.1 Tissue culture and transplanting of C.inerme

3 結(jié)論與討論

苦郎樹莖段外植體用75%酒精處理30 s 和0.1% HgCl2處理7 min，能有效滅菌；最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA，最佳繼代培養(yǎng)基為1/2 MS + 1.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.10 mg/L NAA，生長健壯的植株移栽至珍珠巖、泥炭土和沙子（2∶2∶1）混合基質(zhì)中長勢良好。

建立植物離體快繁體系的前提是能獲得有活力的無菌材料。植物離體培養(yǎng)中的污染源一方面來自于組培過程中的不規(guī)范操作，另一方面來自植物的內(nèi)生菌。組培過程中人為因素造成的污染目前已得到有效控制，但植物內(nèi)生菌的污染難以徹底清除[9-10]。本試驗結(jié)果表明，在消毒滅菌過程中，酒精和HgCl2相結(jié)合的滅菌處理效果好，由于酒精具有較強的滲透性，容易對外植體的活性造成不可逆?zhèn)?，所以在滅菌過程中需嚴格控制酒精的滅菌時間。

由于植物內(nèi)源激素?zé)o法滿足離體組織增殖和生根的需要，因此在組織培養(yǎng)過程中，需要添加適宜的外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這是促進愈傷組織形成、芽的分化以及不定根形成的重要手段之一[11]。NAA和6-BA 對苦郎樹叢芽生長作用顯著，但高濃度6-BA容易導(dǎo)致苦郎樹的外植體褐化嚴重并抑制側(cè)芽形成。本試驗建立了苦郎樹離體培養(yǎng)體系，對苦郎樹種質(zhì)資源的保存以及規(guī)模化育苗具有重要意義。