費(fèi)昭雪， 劉莉麗， 侯 娜， 彭少兵

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院， 楊凌 712100； 2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院， 貴陽(yáng) 550005)

油松(PinustabulaeformisCarriere.)為松科松屬常綠喬木，樹(shù)高可達(dá)30 m以上，胸徑可達(dá)1 m[1]。油松適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛分布于我國(guó)東北、西北、華中、西南等地區(qū)[2-4]。油松材質(zhì)致密耐用，是建筑、造船及家具等的良好用材[5-8]。油松的用途廣泛，市場(chǎng)需求量逐年增加，野生資源已經(jīng)難以滿足需求，主要依靠人工種植，因此，油松苗木供應(yīng)亟待一種快速繁殖的方法。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有高效快速、遺傳穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)成為了油松繁殖的有效途徑[9-11]。試驗(yàn)以油松組織培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)為核心進(jìn)行研究，旨在為相關(guān)的生產(chǎn)研究提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2018年春季采集一年生健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的油松嫩枝作為外植體，在洗潔精水中漂洗3～5 min，洗去材料表面的泥土和灰塵，然后用自來(lái)水進(jìn)行流動(dòng)沖洗，時(shí)間30 min[12]。清洗中修剪過(guò)長(zhǎng)或過(guò)大枝條，隨后用75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1外植體預(yù)處理1.2.2油松外植體的芽分化培養(yǎng)

研究油松的分化，可以為遺傳體系建立和多倍體等實(shí)驗(yàn)做鋪墊，另外，快速繁殖還能夠縮短育種周期，提高藥用成分的含量。實(shí)驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，加入30.0 g·L-1蔗糖，5.0 g·L-1瓊脂，采用正交實(shí)驗(yàn)法設(shè)計(jì)6-BA、TDZ和NAA 三種激素的不同濃度和配比，添加到培養(yǎng)基中[13-16]。分裂素(6-BA)設(shè)置濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1，TDZ設(shè)置濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg·L-1，生長(zhǎng)素(NAA)設(shè)置濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg·L-1。按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9組不同激素濃度配比和1組空白對(duì)照處理。實(shí)驗(yàn)所用材料為健壯無(wú)菌苗，莖段(不帶葉腋)切成長(zhǎng)約1 cm，平鋪于培養(yǎng)基中，每瓶4枚，每組10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同上。在培養(yǎng)期間定期觀察并做好分化率和生長(zhǎng)情況的記錄。

1.2.3油松外植體的芽增殖培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，輔以蔗糖(30.0 g·L-1)，瓊脂(5.0 g·L-1)，以6-BA、TDZ和NAA三種激素濃度及配比為影響因素，采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。分裂素6-BA設(shè)0.1、0.3、0.5 mg·L-1等3個(gè)濃度，TDZ設(shè)0.01、0.05、0.10 mg·L-1等3個(gè)濃度，生長(zhǎng)素NAA設(shè)0.01、0.05、0.10 mg·L-1等3個(gè)濃度。選取消毒備用的材料，切取長(zhǎng)約1 cm帶葉腋的莖段和長(zhǎng)約2 cm的頂芽。莖段平鋪于培養(yǎng)基表面，每瓶4枚，每組10瓶，重復(fù)3次；頂芽插入培養(yǎng)基，每瓶4株，每組10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同上。在培養(yǎng)期間定期觀察并做好增殖情況、平均苗高和生長(zhǎng)情況的記錄。

1.2.4油松不定芽生根培養(yǎng)

以1/2 MS(大量元素及鈣鹽用量減半，其余母液用量不變)為基本培養(yǎng)基，附加30.0 g·L-1蔗糖，5.0 g·L-1瓊脂，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究IBA、NAA 2種激素的不同濃度和活性炭添加量對(duì)油松生根的影響。生長(zhǎng)素(IBA)和NAA濃度梯度均為0.1、0.2、0.3 mg·L-1，活性炭設(shè)0.1、0.2、0.3 g·L-1等3個(gè)濃度。實(shí)驗(yàn)選取健壯的無(wú)菌苗為材料，切取長(zhǎng)約2 cm的頂芽接入培養(yǎng)基中，每瓶4株，每組10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同上。在生根培養(yǎng)期間定期觀察并記錄生根情況，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)和測(cè)量根長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0、Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)油松芽分化的影響

不同培養(yǎng)基對(duì)油松莖段的分化有明顯影響。從表1可以看出，用油松的莖段來(lái)分化，對(duì)照組處理(ck)分化芽數(shù)最低，為0；8號(hào)組合的分化芽數(shù)最高，為3.67。但是8號(hào)處理組合的油松長(zhǎng)勢(shì)欠佳，有的出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不利于后期的繼代繁殖。其中4號(hào)處理組合和6號(hào)處理組合雖然不是分化芽數(shù)最高的，但是其苗高和生長(zhǎng)情況在本實(shí)驗(yàn)中是最好的，且無(wú)玻璃化現(xiàn)象。4號(hào)處理組合的分化芽數(shù)(3.49)比6號(hào)組合的分化芽數(shù)(3.15)高。綜上所述，4號(hào)處理組合為油松莖段最佳分化培養(yǎng)基，即MS+2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)油松莖段分化的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)油松芽增殖的影響

2.2.1不同培養(yǎng)基對(duì)油松莖段芽增殖的影響

不同種類激素濃度的配比對(duì)油松莖段的增殖效率有明顯影響(圖1)。從表2可以看出，沒(méi)有添加激素的組合(ck)增殖系數(shù)最低，為1.75。A 2號(hào)處理組合的增殖系數(shù)為5.33，是實(shí)驗(yàn)組合中增殖系數(shù)最高的，并且增殖的植株長(zhǎng)勢(shì)粗壯。雖然A 4號(hào)處理組合培養(yǎng)基增殖的植株長(zhǎng)勢(shì)粗壯，且增殖系數(shù)達(dá)4.00，但其平均苗高為3.0 cm，較A 2號(hào)處理組合的低。A 1號(hào)和A 6號(hào)處理組合增殖系數(shù)也到達(dá)了4.00，但是長(zhǎng)勢(shì)不如A 2號(hào)處理組合，且存在一定的玻璃化現(xiàn)象。綜合評(píng)定，A 2號(hào)處理組合的增殖系數(shù)、平均苗高、生長(zhǎng)情況是實(shí)驗(yàn)組合中最好的，綜上所述，油松帶葉腋莖段的最佳增殖培養(yǎng)基為A 2號(hào)處理組合MS+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。

注：A為外植體；B、C為愈傷組織；D為油松芽。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)油松莖段增殖的影響

2.2.2不同培養(yǎng)基對(duì)油松頂芽增殖的影響

不同種類激素濃度的配比對(duì)油松頂芽的增殖有明顯影響。從表3可知，以油松頂芽進(jìn)行增殖，對(duì)照處理(ck)增殖系數(shù)最低，為1.33。A 8號(hào)組合的增殖系數(shù)最高，為4.67。但是A 8號(hào)組合的油松長(zhǎng)勢(shì)欠佳，存在一定比例的玻璃化現(xiàn)象，不利于后期的繼代繁殖。其中A 4號(hào)組合和A 6號(hào)組合雖然不是增殖系數(shù)最高的，但是其苗高和生長(zhǎng)情況在本實(shí)驗(yàn)中均是最好的，且無(wú)玻璃化現(xiàn)象。A 4號(hào)組合的增殖系數(shù)(4.29)比A 6號(hào)組合的增殖系數(shù)(4.00)高，綜上所述，油松頂芽的最佳增殖培養(yǎng)基為A 4號(hào)組合MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)油松頂芽增殖的影響

2.3 生根培養(yǎng)

在生根培養(yǎng)的30 d里，不同時(shí)間段植株生根株數(shù)不同，在第10～15天生根植株增加得最多，平均為11株，第15天后生根的株數(shù)逐漸減少。分析其原因?yàn)橛退尚枰劝l(fā)根原基才能順利完成生根，其生根方式為愈傷組織生根。不同的單株所需形成愈傷組織的需求不同，導(dǎo)致某些植株會(huì)優(yōu)先長(zhǎng)出根，導(dǎo)致植株生根株數(shù)出現(xiàn)不規(guī)則遞增的現(xiàn)象。

試驗(yàn)的總平均生根率為66.7%，由表4可看出，對(duì)照組(ck)的生根率最低，而B(niǎo) 1～B 9號(hào)處理組合的生根率為58.3%～91.7%，可以得出油松在激素的誘導(dǎo)下易于生根，無(wú)激素生根較困難。B 1～B 3，B 4～B 6，B 7～B 9號(hào)處理組合中生根率有下降的趨勢(shì)，以3個(gè)編號(hào)為一組進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)， 在IBA濃度保持不變的情況下，生根率隨NAA濃度升高呈下降趨勢(shì)，生根率最高的是B 7號(hào)處理組合(91.7%)，平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)，為0.6 cm，然其苗高最低，為3.1 cm。分析原因?yàn)檩^高濃度的IBA和較低濃度的NAA對(duì)油松生根有良好的促進(jìn)作用，因其有良好的誘導(dǎo)生根效果，但對(duì)植株?duì)I養(yǎng)器官的生長(zhǎng)效果有所減弱，導(dǎo)致植株高度總體偏低。就活性炭添加量而言，B 1、B 6、B 8號(hào)處理組合活性炭添加量為0.1 g·L-1，其平均生根率最低，為66.7%；B 2、B 4、B 9號(hào)處理組合活性炭添加量為0.2 g·L-1，其平均生根率為77.8%； B 3、B 5、B 7號(hào)處理組合活性炭添加量為0.3 g·L-1，其平均生根率為77.8%。因此，活性炭添加量在0.2～0.3 g·L-1范圍內(nèi)時(shí)可促進(jìn)生根。綜上，活性炭作為油松最佳生根培養(yǎng)基為B 7號(hào)處理組合。即1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1。

表4 油松生根數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

油松嫩枝優(yōu)化后的分化培養(yǎng)基是MS+2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。其誘導(dǎo)分化率達(dá)4.49%，誘導(dǎo)分化的不定芽顏色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)較粗壯。

帶腋芽油松莖段組織培養(yǎng)增殖生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。增殖植株生長(zhǎng)粗壯，顏色濃綠，增殖系數(shù)達(dá)5.33；油松頂芽組織培養(yǎng)增殖生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA。在此條件下增殖植株生長(zhǎng)粗壯，顏色濃綠，增殖系數(shù)達(dá)4.29。1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1活性炭為油松生根的最佳培養(yǎng)基。此條件下植株生長(zhǎng)粗壯，生根條數(shù)在5條左右，生根率達(dá)91.7%。

3.2 討 論

MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA培養(yǎng)基能夠較好地呈現(xiàn)油松組織生長(zhǎng)情況，可作為增殖生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基，在此條件下增殖植株生長(zhǎng)粗壯，顏色濃綠，增殖系數(shù)為4.29。實(shí)驗(yàn)中也對(duì)B 5培養(yǎng)基對(duì)油松的增殖效果進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，在MS培養(yǎng)基的增殖效果普遍好于B 5培養(yǎng)基。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，選用油松莖段為材料進(jìn)行增殖時(shí)，會(huì)逐漸膨大產(chǎn)生愈傷組織，培養(yǎng)一段時(shí)間后，愈傷組織開(kāi)始分化出綠色的芽點(diǎn)，隨后分化出芽，因此認(rèn)為，油松更適合于通過(guò)產(chǎn)生愈傷組織來(lái)增殖擴(kuò)繁。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，適宜的培養(yǎng)基種類和激素配比對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)分化、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)均有促進(jìn)作用。有學(xué)者也得到類似的結(jié)論[16]。在試驗(yàn)中也證明了這一點(diǎn)，加激素的處理組明顯比未加激素的對(duì)照組的效果好。此外，在培養(yǎng)過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)增殖植株玻璃化的現(xiàn)象。引起試驗(yàn)材料玻璃化是由于滲透勢(shì)不均衡造成的，當(dāng)植物體內(nèi)的滲透勢(shì)低于培養(yǎng)基較多時(shí)，植物組織會(huì)從培養(yǎng)基中大量吸水，來(lái)促使兩側(cè)的滲透勢(shì)接近。結(jié)果導(dǎo)致培養(yǎng)的材料水分含量較高，呈現(xiàn)一種透明或半透明的狀態(tài)，稱之為玻璃化現(xiàn)象[17]。玻璃化的植株長(zhǎng)勢(shì)弱，不能用作進(jìn)一步增殖和生根的材料，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定的影響。在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不能完全凝固的培養(yǎng)基中容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，一些激素濃度的配比也會(huì)導(dǎo)致一定程度的玻璃化。綜合分析來(lái)看，導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象的因素較多，比如培養(yǎng)材料、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基成分、繼代次數(shù)、植物激素等，但是在所查閱的文獻(xiàn)中未見(jiàn)到對(duì)油松組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中玻璃化現(xiàn)象的講述。