李 麗， 李 云， 張 璠， 潘 牧,3， 楊 航

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 貴陽 550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550006；3.貴州農(nóng)科特創(chuàng)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司， 貴陽 550006)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源用塊根作物，廣泛種植于100多個國家，在世界糧食生產(chǎn)中總產(chǎn)列第7位。我國甘薯年種植面積約660萬hm2，占世界甘薯種植總面積的65.4%，年產(chǎn)量約1.5億t，占世界甘薯總產(chǎn)的85.9%[1]。其原生種主要涉及野生近緣種Ipomoeatrifida的2 x、4 x和6 x多倍體復(fù)合體[2]。甘薯近緣野生種資源豐富，攜帶優(yōu)良的抗性基因，在甘薯育種上發(fā)揮了極其重要的作用。由于甘薯染色體較小，數(shù)目較多，細(xì)胞質(zhì)濃厚和染色能力弱，因而對其細(xì)胞學(xué)研究相對薄弱，滯后于水稻、小麥等其他作物[3]。國外對甘薯的染色體研究起步較早，薛啟汗等[4]報道，甘薯近緣種I.tiliacea為二倍體 (2 n=2 x=30),I.trifida為六倍體(2 n=6 x=90),I.littoralis為四倍體(2 n=4 x=60)。與國際先進(jìn)水平相比，我國甘薯的染色體核型研究工作起步較晚，現(xiàn)主要由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、徐州甘薯研究中心等單位開展工作，目前已取得較大進(jìn)展。曹清河等[5]利用染色體壓片法和花粉粒掃描電鏡法對甘薯近緣野生種IpomoeahederaceaJacq.的體細(xì)胞染色體數(shù)目、核型及其分類地位進(jìn)行分析和界定，明確了該甘薯近緣種的細(xì)胞遺傳學(xué)信息及其在甘薯屬中的進(jìn)化程度。湯佳立等[3]利用熒光原位雜交技術(shù)分析栽培種甘薯(Ipomoeabatatascv.Xushu 18)染色體，發(fā)現(xiàn)徐薯18染色體上有8對或9對強(qiáng)弱不一的45 S rDNA信號，所有染色體的全長分布強(qiáng)烈而密集的雜交信號，著絲粒區(qū)、近著絲粒區(qū)和端粒區(qū)有增強(qiáng)的信號帶。梁國魯?shù)萚6]對甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida的二倍體(2 n=2 x=30)和六倍體(2 n=2 x=90)的核型進(jìn)行了觀察分析，探討了該多倍體復(fù)合體的染色體結(jié)構(gòu)變異與系統(tǒng)演化。而關(guān)于甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida(4 x)的染色體特征研究甚少，其核型信息也缺乏。因此，本研究采用常規(guī)染色體壓片法對甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida(4 x) 的染色體數(shù)目進(jìn)行計數(shù)和核型分析，為探討甘薯多倍體的遺傳學(xué)特征、系統(tǒng)演化及雜交親本選配提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida(4 x)由國家甘薯產(chǎn)業(yè)體系貴陽綜合試驗站提供。

1.2 方 法

1.2.1染色體制片

試驗材料均用甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida(4 x)組培苗萌發(fā)生根，用改良的去壁低滲法[7]制片。

預(yù)處理：待根長1～1.5 cm時，洗凈置于吸水紙上，吸去水分后并將根尖放在濃度為0.002 mol·L-1羥基喹啉中，室溫處理40～60 min，取出用蒸餾水漂洗3～5次。

前固定：用卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)對前低滲后的甘薯根尖進(jìn)行固定2 h。

前低滲：將漂洗好的根尖材料放置蒸餾水中用蒸餾水作為前低滲液浸泡30 min，使染色體易于分散。

解離：將前低滲好的根尖材料放置于0.2 mol·L-1的鹽酸溶液中在50～60 ℃溫度下解離8～10 min。

后低滲：將解離好的根尖材料用蒸餾水漂洗3～5次用最后1次蒸餾水作為后底滲，低滲30 min。

染色：將低滲后的根尖置于干凈載玻片上，加卡寶品紅染液，染色15～30 min。

漂洗：將染色好根尖的材料用45%醋酸溶液漂洗8～10 min。

壓片：將漂洗好的根尖(約0.2 cm)，置于蓋玻片上，在顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.2染色體鏡檢方法

選取染色體完整、分散良好、著絲點清晰的中期分裂相進(jìn)行染色體計數(shù)，在放大倍數(shù)為10×100倍鏡下顯微照相，并結(jié)合Adobe Photoshop CS軟件進(jìn)行調(diào)整,對圖片進(jìn)行排序、剪貼、制成核型圖。

1.2.3核型分析

采用李懋學(xué)等[8]的方法進(jìn)行核型分析，Image-pro plus軟件對染色體的數(shù)目、臂長(包括長臂和短臂)進(jìn)行測量，然后按Levan等[9]的方法計算相應(yīng)的數(shù)據(jù)(包括相對長度、臂比值)。

表1 著絲點位置劃分

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯近緣野生種Ipomoea trifida(4 x)的染色體數(shù)目

對100個近緣野生種Ipomoeatrifida細(xì)胞的染色體數(shù)目及形態(tài)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)近緣野生種染色體為四倍體型。根尖組織細(xì)胞中存在染色體數(shù)有2 n=50、52、54、56、58，其中含有56條染色體的細(xì)胞數(shù)所占比例達(dá)到58%，根據(jù)生物體染色體數(shù)目統(tǒng)計原則，甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida的染色體數(shù)目為2 n=4 x=56。

表2 Ipomoea trifida的核型參數(shù)

2.2 甘薯近緣野生種Ipomoea trifida(4 x)的染色體特征

甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida的染色體數(shù)目為56條，可分為14組(A-N)，每組含有4條染色體(圖1)。甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida的臂比范圍為(1.20±0.36)～(3.64±0.36)之間，相對長度介于(23±6.93)～(26±5.96)之間。根據(jù) Levan等[9]對著絲點的位劃分標(biāo)準(zhǔn)，臂比大于2 的染色體所占比例為0.64，在0.51～0.99 之間，且最長臂/最短臂比值約為1.43，核型不對稱系數(shù)為58.22%，其核型分類屬3 A型。其核型公式為：2 n=4 x=56=6 m+4 sm+1 st+3 t。

注：a，b為甘薯近緣野生種Ipomoea trifida染色體原始圖； c為甘薯近緣野生種Ipomoea trifida染色體配對圖

3 討 論

Ipomoeatrifida是一個復(fù)合種，包括二倍體、 四倍體、六倍體及其雜種，廣泛分布于墨西哥-厄瓜多爾-巴西的熱帶美洲[6]。將甘薯品種之間進(jìn)行任意雜交，能夠分離出莖細(xì)、不結(jié)塊根的野生類型, 從表型上很難將其分開, 因此可以通過現(xiàn)代生物技術(shù)、基因工程等方法將其區(qū)別。染色體核型分析是開展雜交育種、多倍體誘導(dǎo)和雌核發(fā)育等遺傳育種工作的基礎(chǔ)，對研究植物系統(tǒng)演化、物種之間的親緣關(guān)系、起源、進(jìn)化與分類，遠(yuǎn)緣雜交及遺傳工程中的染色體鑒別具有重要意義[10]。甘薯近緣野生種被認(rèn)為是開拓甘薯育種新的抗病、優(yōu)質(zhì)、抗逆等基因的重要來源之一，以近緣野生種作母本，綜合性狀較好的地方品種、新育成品系和外引品種資源作父本，讓其雜交，已成為甘薯常規(guī)育種的手段之一。Ipomoeatrifida(4 x)種包含多個系統(tǒng)，推測有的Ipomoeatrifida(4 x)株系是Ipomoeatrifida(2 x)直接加倍產(chǎn)生的，有的是基因組重組與部分變異產(chǎn)生的，但表型均為野生型[11]。由于甘薯染色體的總體特征表現(xiàn)為小且多，本試驗中，甘薯材料黔薯7號和黔薯6號因淀粉粒較多，染色難，不能確定其染色體數(shù)目和核型特征。本研究僅對甘薯近緣野生種Ipomoeatrifida(4 x)作了初步分析，要深入探討甘薯的起源問題，還需結(jié)合分子生物學(xué)手段對不同類型、品種的甘薯進(jìn)一步開展核型分析。