許先猛 張?jiān)鰩?郭俊花 盧 軍

(1. 安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2. 運(yùn)城職業(yè)技術(shù)大學(xué)健康學(xué)院, 山西 運(yùn)城 044000; 3. 漢中市食品藥品監(jiān)督管理局, 陜西 漢中 723000)

酚類化合物是植物生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，常以酚酸和黃酮類化合物形式存在[1-2]。蘋果多酚(apple polyphenols, AP)是蘋果中多元酚類化合物的總稱，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為一個(gè)及一個(gè)以上苯環(huán)結(jié)合多個(gè)羥基[3]，含有綠原酸、兒茶素、黃烷醇、黃酮醇、花色苷、根皮苷、原花青素、原花色素等生物活性成分[4-6]，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤、抗癌等功能活性[2,7-10]，是國際天然產(chǎn)物資源研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一。蘋果多酚提取和純化技術(shù)是蘋果多酚的主要研究方向，通過物理、化學(xué)和生物方法提高蘋果多酚提取率和產(chǎn)品純度，是蘋果多酚研究和應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。

1 蘋果多酚提取技術(shù)

1.1 溶劑提取法

蘋果多酚溶劑提取法常用的溶劑主要為有機(jī)溶劑，其提取依據(jù)是物質(zhì)相似相溶原理。蘋果多酚中的酚羥基基團(tuán)以氫鍵的形式與蛋白質(zhì)等大分子形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，甲醇、乙醇、丙酮等親水性有機(jī)溶劑可以破壞氫鍵，提高蘋果多酚提取率。葛曉虹等[11]從工業(yè)蘋果渣中提取多酚，其最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)54.46%，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間3.5 h，液料比(V乙醇∶m蘋果渣)62.3∶4.0 (mL/g)，此時(shí)蘋果多酚得率為4.48 mg/g。溶劑提取法具有操作簡單，提取率較高，工業(yè)生產(chǎn)設(shè)備要求低等優(yōu)勢，但存在有機(jī)溶劑消耗量大、產(chǎn)品有機(jī)溶劑殘留以及生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)。輔助物理、化學(xué)和生物方法，提高蘋果多酚提取率，降低有機(jī)溶劑用量，減少產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留等，將是溶劑提取法提取蘋果多酚的重要研究方向。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取過程中會(huì)產(chǎn)生空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等，多級效應(yīng)相結(jié)合會(huì)產(chǎn)生高剪切作用力，產(chǎn)生微射流，加速蘋果細(xì)胞壁破碎速度，增強(qiáng)溶劑滲透作用，提高傳質(zhì)效率，縮短提取時(shí)間，提高蘋果多酚提取率和提取效率。田莉等[12]利用真空耦合超聲波提取技術(shù)從紅富士蘋果渣干粉中提取蘋果多酚，在乙醇濃度50%，提取溫度50 ℃，真空度0.08 MPa，超聲功率420 W，提取時(shí)間13 min，料液比(m蘋果渣∶V乙醇)1∶30 (g/mL)條件下，蘋果多酚得率為6.46 mg/g。齊娜等[13]利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取新疆紅肉蘋果多酚工藝條件，在料液比(m蘋果∶V溶劑)為1∶4 (g/mL)，超聲功率為360 W，提取溫度為62 ℃，提取時(shí)間為20 min下，新疆紅肉蘋果全果多酚得率為2.135 mg/g。金瑩等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溫度為60 ℃，料液比(m蘋果∶V溶劑)為1∶6 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為30 min時(shí)，超聲波輔助提取國光蘋果新鮮蘋果渣中蘋果多酚提取率為87.63%，較普通溶劑法提高了8.39%。研究[15]表明，低功率(50 W)超聲波對蘋果多酚的大孔吸附樹脂吸附和解吸也有積極作用，可明顯促進(jìn)大孔吸附樹脂對蘋果多酚的吸附動(dòng)力學(xué)過程，提高蘋果多酚吸附能力，顯著提高蘋果多酚的大孔吸附樹脂解吸率，將蘋果多酚回收率提高至125%。超聲波輔助提取法具有提取率高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，但是超聲波輔助設(shè)備體積和容積一般較小，單次生產(chǎn)量較小，工作過程中會(huì)產(chǎn)生噪音污染，因此企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)存在一定困難。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取技術(shù)的主要原理是高頻電磁波可直接作用于提取物細(xì)胞系統(tǒng)，細(xì)胞內(nèi)含有的水分子等極性物質(zhì)快速吸收微波能并產(chǎn)生大量熱量，細(xì)胞因內(nèi)部受熱膨脹而發(fā)生破裂或破碎，加快提取溶劑的滲透，從而提高蘋果多酚提取率和提取效率。Bai等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微波功率為650.4 W，萃取時(shí)間為53.7 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)為62.1%，V溶劑∶m原料為22.9∶1.0 (mL/g)時(shí)，微波輔助法提取蘋果渣中多酚得率為(62.68±0.35) mg GAE/100 g；與溶劑回流提取法[得率(46.33±0.58)mg GAE/100 g]和超聲輔助提取法[得率(54.76±0.39)mg GAE/100 g]相比，微波輔助法的多酚得率分別提高了35.29%，14.46%。李健等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，微波功率為640 W，提取時(shí)間為70 s，料液比(m蘋果∶V溶劑)為1∶14 (g/mL)時(shí)，微波輔助法提取蘋果多酚提取率達(dá)9.92 mg/g。在蘋果渣原料預(yù)處理過程中，榨汁會(huì)使蘋果多酚有一定的損失，干燥、粉碎過程產(chǎn)生的高溫和氧化也會(huì)導(dǎo)致蘋果多酚的損失，因此工業(yè)蘋果渣干粉和新鮮蘋果渣中蘋果多酚含量差異顯著。微波輔助法提取蘋果多酚效率高、產(chǎn)品安全無污染，但因設(shè)備要求限制，其在工業(yè)化生產(chǎn)中的技術(shù)應(yīng)用尚不成熟。

1.4 超臨界CO2流體萃取法

超臨界流體是指處于臨界點(diǎn)的流體，處于氣態(tài)與液態(tài)之間的一種特殊狀態(tài)[18]。CO2因性質(zhì)穩(wěn)定、無毒無害、易于分離等優(yōu)勢常被作為溶劑，超臨界CO2流體萃取技術(shù)是以CO2為溶劑，在超臨界狀態(tài)下改變CO2臨界壓力或臨界溫度，從而將提取物中生物活性物質(zhì)萃取出來。超臨界CO2流體萃取的活性成分純度高、無溶劑殘留、質(zhì)量好，但提取率偏低，通常借助醇、水等介質(zhì)聯(lián)合提取以提高提取率。魏福祥等[19]采用超臨界流體萃取蘋果渣中的多酚，將蘋果渣過40目篩，在壓力為35 MPa，溫度為50 ℃，CO2流量為45 kg/h條件下萃取3 h，蘋果多酚得率為0.1%。Elizabeth等[20]在原料粒徑>250 μm，V乙醇∶m物料為1∶1 (mL/g)，萃取溫度60 ℃，助溶劑CO2流量為24 mL/min，壓強(qiáng)為55.0 MPa，靜態(tài)提取時(shí)間5 min，動(dòng)態(tài)提取時(shí)間10 min下，蘋果多酚提取率為0.979 8 mg GAE/g，表兒茶素提取率為288.3 μg/g。超臨界CO2流體萃取技術(shù)的工業(yè)化設(shè)備設(shè)計(jì)改造、成本控制和工業(yè)化生產(chǎn)工藝優(yōu)化是今后超臨界CO2流體萃取技術(shù)生產(chǎn)蘋果多酚的研究重點(diǎn)。

1.5 生物酶解提取法

生物酶具有高效、專一等特點(diǎn)，生物活性物質(zhì)提取常用的生物酶類有纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶及酯酶等，這些酶類可以降解蘋果組織中的細(xì)胞壁和細(xì)胞間物質(zhì)，增加溶劑滲透作用，提高傳質(zhì)效率，從而提高活性物質(zhì)提取率。李映等[21]使用纖維素酶和果膠酶酶解茶葉提取茶多酚，在復(fù)合酶用量2.4%，料液比(m茶∶V溶劑)1∶10 (g/mL)，酶解pH 5.6，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間75 min下，茶多酚產(chǎn)率為23.36%，比未加酶的產(chǎn)率提高了55.94%。王莉等[22]采用角質(zhì)酶在乙醇溶液中提取蘋果多酚，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，料液比(m蘋果∶V溶劑)為1∶50 (g/mL)，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min，酶添加量為2 000 U/g·基質(zhì)，pH為7.5時(shí)，蘋果多酚提取率達(dá)99.16%。袁晶等[23]采用超聲波輔助復(fù)合酶法提取蘋果漿中蘋果多酚，當(dāng)復(fù)合酶(m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1)添加量為0.07%，酶解時(shí)間為60 min，提取溫度為65 ℃，超聲輔助時(shí)間為10 min時(shí)，蘋果多酚得率為1.99 mg/g，較未添加纖維素酶的得率提高了25.56%。生物酶解提取法的提取速度快、提取率高、有機(jī)溶劑使用量少，但酶制劑成本高。

1.6 高壓輔助萃取法

高壓和超高壓環(huán)境下，蘋果組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生破裂和解體，可加快提取溶劑滲透，促使細(xì)胞內(nèi)多酚成分快速釋放，能夠有效提高多酚提取率。Alonso-Salces等[24]研究表明，加壓(6.9 MPa)條件下利用甲醇溶液提取金冠蘋果皮中蘋果多酚5 min，其得率為7.566 mg/g，與常壓提取法相比，該方法大大縮短了提取時(shí)間。高壓輔助法提取蘋果多酚還可以有效提高蘋果多酚提取率和純度，彭雪萍等[25]采用超高壓輔助法提取新鮮紅富士蘋果渣中蘋果多酚，當(dāng)壓力為200 MPa，提取時(shí)間為2 min，固液比(m蘋果∶V溶劑)為1∶6 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，蘋果多酚提取率高達(dá)11.69%，純度為37.61%；與常壓提取法相比，其提取時(shí)間大大縮短，蘋果多酚提取率較常壓提取高20%，蘋果多酚純度提高了30%。高壓輔助萃取法的提取時(shí)間短、提取率高，其提取過程可實(shí)現(xiàn)密封和避光以減少光和氧氣對蘋果多酚的影響，因蘋果渣中糖含量較高，高壓輔助萃取法提取蘋果多酚會(huì)受到一定影響。

1.7 其他提取方法

隨著提取技術(shù)研究的不斷深入，越來越多的高新提取技術(shù)被應(yīng)用于蘋果多酚提取過程中。表面活性劑是一類具有長疏水鏈和離子親水頭的兩親分子，在臨界膠束濃度以上，表面活性劑形成由親水表面和疏水核組成的膠束。這種特殊的結(jié)構(gòu)使膠束能夠與親水性或親脂性物質(zhì)建立化學(xué)和物理相互作用，并提取酚類化合物。Liubov等[26]采用非離子乳化劑提取蘋果多酚，當(dāng)提取溶劑為1.14%吐溫80，提取時(shí)間為65 min，液料比(V溶劑∶m物料)為104∶1 (mL/g)，pH為3.8時(shí)，蘋果多酚得率為7.75 mg/g。Malinowska等[27]采用表面活性劑的水溶液從蘋果渣中提取和分離蘋果多酚，其提取率高于水、乙醇作為提取劑的提取方法。

脈沖電場是一種非熱加工技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)將高強(qiáng)度的電場脈沖作用于兩電極之間。脈沖電場在細(xì)胞膜上引起跨膜電位差，當(dāng)電位差達(dá)到臨界值時(shí)，電擊穿可導(dǎo)致細(xì)胞膜電穿孔，增加細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)活性成分更容易被釋放。Lohani等[28]采用脈沖電場輔助提取蘋果渣中蘋果多酚，當(dāng)料液比(m蘋果渣∶V溶劑)為12.5∶1.0 (g/mL)，電場強(qiáng)度為2 kV/cm，提取時(shí)間為500 μs時(shí)，與普通溶劑提取法相比，蘋果多酚得率提高了37.4%。

2 蘋果多酚的分離純化技術(shù)

由于蘋果多酚提取技術(shù)選擇性較差，提取制備的蘋果多酚粗提物純度較低，蘋果多酚功能活性因粗提物中蘋果多酚含量偏低而受限制，因此蘋果多酚粗提物需進(jìn)行有效純化后才能得到高純度產(chǎn)品。近年來，蘋果多酚提取、純化技術(shù)水平不斷提高，其提取率偏低問題已得到了有效改善。目前，蘋果多酚常見的分離純化技術(shù)有大孔吸附樹脂法、固相萃取法、高效液相色譜法、高速逆流色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法等。

2.1 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂純化法是通過大孔樹脂與被吸附蘋果多酚之間的氫鍵和范德華力等作用進(jìn)行吸附，然后根據(jù)蘋果多酚的性質(zhì)選擇合適的溶劑進(jìn)行解吸，從而達(dá)到對蘋果多酚進(jìn)行純化的目的。大孔樹脂具有吸附量大、吸附率高、容易解吸、可重復(fù)利用和易于工業(yè)化等優(yōu)勢[29]，因此被廣泛應(yīng)用于蘋果多酚的分離純化。賀金娜等[30]采用XAD-7HP型大孔吸附樹脂純化蘋果渣中蘋果多酚，當(dāng)提取液上樣質(zhì)量濃度為1.46 mg/mL、pH值為5.50、上樣速度為1.25 mL/min，洗脫劑為90%丙酮、洗脫速度為1.0 mL/min 時(shí)，其純度提高了10倍多，達(dá)80.1%。王振宇等[31]采用AB-8型大孔吸附樹脂純化蘋果渣中蘋果多酚，純化條件為1.5 g/L蘋果多酚提取液、上樣速度1 mL/min、蒸餾水洗脫后60%丙酮洗脫，洗脫速度0.5 mL/min，此時(shí)蘋果多酚純度為79.5%。Wang等[15]采用超聲波輔助XDA-16大孔吸附樹脂純化蘋果皮多酚，50 W功率處理下蘋果皮多酚回收率提高了38.3%。大孔吸附樹脂純化法的產(chǎn)品純度高、產(chǎn)量大、成本低，是目前蘋果多酚純化工業(yè)化生產(chǎn)最常用的方法。

2.2 固相萃取法

固相萃取法是根據(jù)分離純化蘋果多酚的性質(zhì)選擇固定相與流動(dòng)相，由于固定相將蘋果多酚和雜質(zhì)吸附并保留在固相萃取柱上的時(shí)間和能力不同，從而實(shí)現(xiàn)對蘋果多酚和雜質(zhì)的高選擇性分離，以純化蘋果多酚。賀金娜等[32]采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱對蘋果多酚粗提液進(jìn)行純化，得到7種中性多酚和3種酸性多酚，分別為原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、異槲皮素、槲皮苷、根皮苷、根皮素、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸10種多酚單體。張素寧等[33]采用磁性固相萃取—液相色譜法測定蘋果汁中酚類物質(zhì)，建立了MSPE-HPLC-UV聯(lián)用測定蘋果汁中雙酚 A、雙酚 F、雙酚 AF 3種雙酚類物質(zhì)的方法，發(fā)現(xiàn)基于Fe3O4@ TRITER-1磁性固相萃取吸附劑的凈化效果良好，檢測方法可靠。固相萃取法純化蘋果多酚具有純度高、質(zhì)量高等優(yōu)勢，在蘋果多酚單體分離、純化和鑒定應(yīng)用較為廣泛。

2.3 其他方法

隨著純化技術(shù)研究的不斷深入，高速逆流色譜法、高效液相色譜法、凝膠色譜法等色譜技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蘋果多酚的純化。Cao等[34]采用凝膠色譜—高速逆流色譜法純化蘋果多酚，從蘋果渣中獲得了6種主要的目標(biāo)單體多酚：綠原酸、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-木糖苷、根皮苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷和槲皮素-3-鼠李糖苷。李志華等[35]采用大孔吸附樹脂、硅膠柱色譜、ODS柱色譜、凝膠柱色譜、高效液相色譜法等先后對蘋果多酚進(jìn)行提取和分階段純化，分離純化出25種化合物，包括槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、根皮苷等，其中黃酮類成分占40%。郭娟等[36]采用Sephadex LH-20對蘋果多酚粗提液進(jìn)行吸附，然后采用80%乙醇進(jìn)行洗脫，純化后的蘋果多酚純度達(dá)84.7%。色譜法純化蘋果多酚具有產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)，在蘋果多酚成分單體分離和鑒定中研究較多，但因設(shè)備價(jià)格昂貴及設(shè)備對工作環(huán)境要求高，在工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用較少。

3 總結(jié)

超聲波輔助提取法、微波輔助提取、超臨界CO2流體萃取技術(shù)、生物酶解提取法和高壓輔助萃取法等新技術(shù)的應(yīng)用大大提高了蘋果多酚提取率。蘋果多酚分離純化常用的方法包括大孔吸附樹脂法、固相萃取法、硅膠柱色譜法、ODS柱色譜法、凝膠柱色譜法、高效液相色譜法等，其中大孔吸附樹脂法因吸附量大、吸附率高和易于工廠化生產(chǎn)，在蘋果多酚純化和工業(yè)化生產(chǎn)過程中被廣泛應(yīng)用。隨著蘋果多酚產(chǎn)品需求量的不斷增大，綠色無污染、低成本、高產(chǎn)量、高純度、高質(zhì)量的蘋果多酚提取和純化一體化技術(shù)勢必成為今后蘋果多酚研究的主要內(nèi)容。