畢慶慶，朱婕，張磊，牟曉峰

根據(jù)Global Cancer Statistics 2018的統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)每年約有57萬(wàn)例新增宮頸癌患者，宮頸癌致死的患者約為31.1萬(wàn)例［1］。在全球范圍內(nèi)，宮頸癌的發(fā)病率和病死率均排在所有女性腫瘤的第四位［1］。而在宮頸癌篩查措施相對(duì)欠缺的發(fā)展中國(guó)家女性中，宮頸癌的發(fā)病率和病死率均排在第二位，僅次于乳腺癌［1］。一種或多種高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸瘤變的必要和高危因素［2］。宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）是宮頸惡性病變的前兆，病理分級(jí)從低到高依次為CIN1級(jí)、CIN2級(jí)和CIN3級(jí)。高危型HPV感染出現(xiàn)在90%以上的宮頸癌和60%以上的CIN患者中［3］。

生殖道內(nèi)正常的定植菌群、宿主免疫調(diào)節(jié)以及宮頸陰道解剖結(jié)構(gòu)之間構(gòu)成動(dòng)態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，保持著生殖道的健康狀態(tài)［4］。近年來(lái)，越來(lái)越豐富的研究證據(jù)顯示，生殖道的菌群環(huán)境和菌群結(jié)構(gòu)改變與HPV感染、持續(xù)感染和黏膜局部免疫以及CIN進(jìn)展關(guān)系緊密［5］。本研究分析了HPV持續(xù)感染患者、HPV一過(guò)性感染患者及健康體檢者的生殖道菌群情況，發(fā)現(xiàn)了一些與HPV持續(xù)感染相關(guān)的菌群，這將為更早地將HPV持續(xù)感染和一過(guò)性感染患者區(qū)分提供幫助，甚至提早干預(yù)、逆轉(zhuǎn)持續(xù)感染，進(jìn)而有效地降低宮頸癌發(fā)病率，具有重要的臨床意義。

本研究?jī)r(jià)值：

本研究分析了人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染者和HPV一過(guò)性感染者的生殖道菌群特征，找出了與高危型HPV持續(xù)感染密切相關(guān)的生殖道定植菌屬，為差異菌種成為潛在的宮頸惡性病變生物標(biāo)志物提供了數(shù)據(jù)支持，為宮頸惡性病變的預(yù)防提供了新策略、新技術(shù)，具有理論與臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1—6月于青島市中心醫(yī)院婦科體檢或診治的女性15例，根據(jù)HPV感染情況共分為HPV持續(xù)感染組6例、HPV一過(guò)性感染組4例、HPV陰性組5例，均為健康體檢者。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將同一型別HPV感染持續(xù)12個(gè)月以上定義為HPV持續(xù)感染者，12個(gè)月內(nèi)HPV感染清除定義為HPV一過(guò)性感染者［6］。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡21～65歲，有性生活史，48 h內(nèi)無(wú)陰道沖洗，3 d內(nèi)無(wú)性生活史、陰道上藥史，1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)性使用抗生素或抗真菌藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：有流產(chǎn)史且目前妊娠，子宮全切手術(shù)史，有其他基礎(chǔ)性疾病。本研究經(jīng)青島市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)；研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本由婦科醫(yī)生采集：通過(guò)窺陰器暴露宮頸，拭去宮頸口及周邊分泌物，使用細(xì)胞刷刮取宮頸管上皮，在宮頸管內(nèi)旋轉(zhuǎn)360°并停留5 s后取出。每例患者收集兩份宮頸標(biāo)本，分別用于HPV基因分型分析和16s rRNA測(cè)序。采集宮頸標(biāo)本后使用專用采集管儲(chǔ)存、送檢。

1.2.2 基因型分析 HPV基因分型分析采用PCR反向點(diǎn)雜交法。對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物加入全自動(dòng)核酸雜交儀進(jìn)行雜交反應(yīng)。陰性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：僅內(nèi)質(zhì)控點(diǎn)（Internal Control）顯色；陽(yáng)性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)質(zhì)控點(diǎn)顯色且相應(yīng)基因型處顯色視為特定基因型陽(yáng)性。

1.2.3 生殖道樣本的16s rRNA測(cè)序 16s rRNA測(cè)序流程如下：第一步：DNA提取與檢測(cè)，采用CTAB法提取樣本基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μl。第二步：PCR擴(kuò)增，以稀釋后的基因組DNA為模板，采用正向引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增16s rRNA基因的V4區(qū)域。PCR反應(yīng)采用Phusion?高保真PCR Master Mix （New England Biolabs）進(jìn)行。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；30個(gè)循環(huán)（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min。第三步：PCR產(chǎn)物純化，將等量的1X緩沖液（含SYB green）與PCR產(chǎn)物混合，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，使用Gene JETTM凝膠提取試劑盒（Thermo Scientific）對(duì)混合PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。第四步：文庫(kù)制備及上機(jī)測(cè)序，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns（Thermo Scientific）生成測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)Qubit@ 2.0熒光計(jì)（Thermo Scientific）進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估。最后在Ion S5TM XL平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 第一步：對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，獲得有效數(shù)據(jù)（Clean Data）。第二步：基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類分析和物種分類分析。第三步：對(duì)每個(gè)OTUs的序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況；對(duì)OTUs進(jìn)行物種豐度、Alpha多樣性分析。第四步：對(duì)OTUs進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，探究不同樣本或組別間微生物群結(jié)構(gòu)的差異。第三、四步均基于OTUs聚類分析結(jié)果進(jìn)行。第五步：采用t檢驗(yàn)、Wilcox檢驗(yàn)、LEfSe等統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)不同組別樣本的物種組成和菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組生殖道菌群特征 選取每個(gè)樣本和三組在門水平上最大豐度排名前10名的物種，以反映物種的相對(duì)豐度。HPV陰性組和HPV一過(guò)性感染組的生殖道菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)單一，厚壁菌門占據(jù)主要地位；而HPV持續(xù)感染組的生殖道菌群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)復(fù)雜化趨勢(shì)，變形菌門和擬桿菌門的豐度較高（見圖1）。

2.2 樣品Alpha多樣性分析 HPV持續(xù)感染組豐度、Shannon指數(shù)高于HPV一過(guò)性感染組和HPV陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006 6、0.024 6；P=0.004 6、0.001 8）；HPV一過(guò)性感染組和HPV陰性組豐度、Shannon指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.419 1、0.806 1，見圖2）。

2.3 物種顯著性差異分析 HPV持續(xù)感染組和HPV一過(guò)性感染組厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門平均物種豐度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，見表1）。對(duì)組間的物種豐度數(shù)據(jù)通過(guò)秩和檢驗(yàn)分析組間的差異物種，并通過(guò)線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）進(jìn)行降維分析，從而評(píng)估和計(jì)算差異顯著物種對(duì)群落的影響大小，即得到LDA score，發(fā)現(xiàn)LDA score>4的Biomarker共有36個(gè)（見圖3A）。根據(jù)整體上展示差異物種在不同組別間分布情況的Heatmap圖，具有顯著性差異的菌屬主要包括不動(dòng)桿菌屬、普雷沃菌屬、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等（見圖3B）。

圖1 三組物種相對(duì)豐度分布Figure 1 Taxonomy relative abundance at phylum level

圖2 三組Alpha多樣性Figure 2 Alpha diversity

表1 HPV持續(xù)感染組和HPV一過(guò)性感染組的差異菌門（ ±s）Table 1 Bacteria phylum differences between persistent and transient HPV infection groups

表1 HPV持續(xù)感染組和HPV一過(guò)性感染組的差異菌門（ ±s）Table 1 Bacteria phylum differences between persistent and transient HPV infection groups

注：HPV=人乳頭瘤病毒

組別 例數(shù) 厚壁菌門 變形菌門 擬桿菌門HPV持續(xù)感染組 6 0.301 4±0.196 6 0.281 1±0.191 2 0.105 6±0.052 0 HPV一過(guò)性感染組 4 0.880 5±0.194 1 0.011 8±0.016 8 0.005 1±0.005 4 t值 -4.585 2.754 3.775 P值 0.002 0.025 0.013

圖3 LEfSe分析結(jié)果Figure 3 Results of LEfSe analysis

3 討論

近年來(lái)，有研究證實(shí)宮頸惡性病變的發(fā)生與高危型HPV的持續(xù)感染相關(guān)［7］，一般認(rèn)為高危型HPV感染持續(xù)12個(gè)月以上未清除即為持續(xù)感染［6］。HPV持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸局部微環(huán)境變化，隨之而來(lái)的是免疫抑制、細(xì)胞增殖、血管形成及組織分化等，這一系列過(guò)程中任何調(diào)控因子的改變均可能會(huì)引起宮頸細(xì)胞的癌變。因此，早期區(qū)分HPV持續(xù)感染和HPV一過(guò)性感染是宮頸癌臨床研究中亟待解決的問(wèn)題之一，且該問(wèn)題的解決將為宮頸癌的早期干預(yù)、持續(xù)感染的逆轉(zhuǎn)提供依據(jù)，對(duì)降低宮頸癌的發(fā)病率具有重要的臨床意義。

系統(tǒng)性的生殖道菌群研究在近幾年逐漸興起，2011年P(guān)NAS雜志上的一項(xiàng)研究首次提出將陰道菌群分為5個(gè)類群（community state types，CST），其中CSTⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型分別代表了以卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、惰性乳桿菌和詹氏乳桿菌為優(yōu)勢(shì)的類型，CSTⅣ型以厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌群、乳桿菌明顯減少［8］。CSTⅠ、Ⅱ、Ⅴ型的陰道菌群一般代表正常的陰道菌群類型，而CSTⅣ型代表的是菌群多樣性顯著增加的異常陰道菌群類型。值得注意的是，以惰性乳桿菌為代表的CSTⅢ型代表了陰道菌群的亞健康狀態(tài)，該類菌群最容易向CSTⅣ型轉(zhuǎn)化并誘發(fā)疾?。?］。另外，上述研究大多基于北美白種女性，也提及女性生殖道菌群特征在不同人種中具有顯著差異［8］。在健康女性中，有80%的亞洲女性和60%的西班牙裔女性生殖道菌群以乳桿菌占優(yōu)勢(shì)，在黑人女性中這一數(shù)值則低至37%～40%［10］。因此，了解特定人群健康與疾病生殖道菌群特征對(duì)進(jìn)一步理解其與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用、引發(fā)疾病的機(jī)制具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，本地區(qū)HPV陰性的健康女性的宮頸菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)單一，以乳桿菌為主；而在高危型HPV持續(xù)感染者中，宮頸菌群多樣性明顯增加，且菌群組成中厭氧菌的比例顯著上升，這和中國(guó)西北地區(qū)和南方地區(qū)的高危型HPV感染與微生物組成相關(guān)性分析結(jié)果一致［11-12］。此外，在HPV持續(xù)感染的患者中，包含乳桿菌屬的厚壁菌門的豐度顯著降低，而變形菌門和擬桿菌門的豐度則顯著增高，這或與HPV持續(xù)感染相關(guān)，是HPV持續(xù)感染的高危因素。

目前國(guó)內(nèi)的類似研究多將研究對(duì)象確定為宮頸癌患者、HPV陽(yáng)性患者或陰性就診者，較少關(guān)注持續(xù)感染這一更常見的臨床表現(xiàn)，本研究以HPV持續(xù)感染者和HPV一過(guò)性感染者為研究對(duì)象，進(jìn)行16s rDNA測(cè)序，進(jìn)一步利用統(tǒng)計(jì)分析方法尋找到36個(gè)在組間有顯著差異的物種，其中具有顯著性差異的代表性菌屬包括不動(dòng)桿菌屬、普雷沃菌屬、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等，這為區(qū)分HPV持續(xù)感染和HPV一過(guò)性感染患者提供了有效的方式，有著更直接的臨床意義。之前的一項(xiàng)研究表明，對(duì)于普雷沃菌屬和假單胞菌屬豐度較高的女性，HPV清除更為困難，且更容易發(fā)展為持續(xù)感染［13］。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬與HPV持續(xù)感染相關(guān)，但在已發(fā)表文獻(xiàn)中尚未報(bào)道，而差異菌屬與HPV和宿主免疫之間的相互作用需要進(jìn)一步研究?？傊?，上述結(jié)果將為區(qū)分HPV持續(xù)感染和HPV一過(guò)性感染提供一種有效的方法，具有一定的臨床意義。

雖然本研究結(jié)果提示生殖道菌群改變與HPV持續(xù)感染相關(guān)，但是以目前的研究結(jié)果無(wú)法判斷是菌群結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致了HPV持續(xù)感染，還是HPV持續(xù)感染引起了菌群結(jié)構(gòu)的改變。進(jìn)一步的研究應(yīng)當(dāng)關(guān)注整個(gè)生殖道微環(huán)境，研究生殖道菌群、HPV感染和宿主免疫系統(tǒng)的相互作用在宮頸癌前病變發(fā)生發(fā)展中的作用。此外，本研究樣本量偏少，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本檢測(cè)量，找到HPV持續(xù)感染相關(guān)的特定菌屬，還可使用單分子測(cè)序技術(shù)（single molecule real time，SMRT）檢測(cè)樣本，而將差異菌注釋到種水平則有更顯著的臨床意義。

作者貢獻(xiàn)：畢慶慶、張磊、牟曉峰進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，結(jié)果的分析與解釋，文章的撰寫及審校；畢慶慶、朱婕、張磊進(jìn)行研究的可行性分析與具體實(shí)施，包括數(shù)據(jù)采集、整理、分析；畢慶慶、張磊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；牟曉峰進(jìn)行論文的修訂，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。