鄭海香，丁明珠，張雨琪，施佳健，張璐，景月娥，王星

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福州 350108)

全球每年約有200萬新發(fā)癌癥病例與感染相關(guān)，占全年新發(fā)癌癥病例的15.4%。感染相關(guān)腫瘤在中國占比約為26.1%，居亞洲之首，積極預(yù)防病原體的感染對減輕未來全球癌癥負擔將產(chǎn)生重大的積極意義[1]。致癌病原體中涵蓋了目前公認的7種人類腫瘤病毒：HBV、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、EB 病毒(epstein-barr virus，EBV)、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)、人類 T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型(human T lymphocytic leukemia virus type I，HTLV-1)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹 病 毒 (kaposi’ s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)和最新的Merkel細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCPyV)，HBV 是其中臨床危害最嚴重的DNA腫瘤病毒[2]。在我國，HBV或HCV介導(dǎo)的肝炎、肝纖維化和肝硬化是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的根本原因之一，其中HBV相關(guān)的HCC占據(jù)所有病例的60%以上[3]。盡管人們對病毒相關(guān)肝癌的臨床表現(xiàn)和干預(yù)手段已經(jīng)有了相當深入的認識，但HBV致瘤的具體機制仍不是十分清楚，一個重要的限速步驟就是缺乏感染背景下的致瘤動物模型。目前最為廣泛使用的HBV相關(guān)肝癌動物模型主要集中于模式化小鼠。主要是在聯(lián)合致癌劑、細胞癌基因或單獨使用組織特異性啟動子情況下，觀察轉(zhuǎn)基因小鼠中病毒癌基因?qū)ο鄳?yīng)表型的誘導(dǎo)能力，或使用HBV陽性的腫瘤細胞系或者肝癌組織移植到免疫缺陷小鼠身上復(fù)制出相關(guān)表型。HBV肝癌小鼠不同模型間的功能側(cè)重和適用范圍差異巨大，本綜述擬詳盡梳理并比較它們之間的病毒感染復(fù)制特點及致瘤特性，以期為研究者選擇正確的模型開展靶向藥物或疫苗研究提供參考。

1 基于基因工程的肝癌小鼠模型

1.1 基于HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的肝癌模型(HBx transgenic mice，HBx-Tg)

在HBV編碼的分子中，x蛋白在HCC的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，被認為是主要的病毒癌蛋白。HBx蛋白作為病毒基因轉(zhuǎn)錄的反式激活因子，被證實可廣泛與細胞增殖和存活的關(guān)鍵信號通路互作，導(dǎo)致肝細胞癌的發(fā)生[4]。早在1991年，研究人員就在病毒自身元件調(diào)控作用下將HBx基因插入小鼠的基因組中建立了單個病毒基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。然后觀察到該小鼠肝中出現(xiàn)多灶性區(qū)域病變，繼以良性腺瘤后發(fā)展為惡性腫瘤[5]。同時，84%的HBx高表達小鼠被發(fā)現(xiàn)于13～24個月內(nèi)發(fā)生HCC。HBx-Tg被認為是研究x蛋白在病毒基因表達調(diào)控從而致瘤的分子機制以及臨床前藥物篩查的良好模型。

但許多報道指出最初建立的HBx轉(zhuǎn)基因小鼠具有如下缺陷：(1)小鼠模型技術(shù)要求高、制備周期長。一般在13～24個月產(chǎn)生肝惡性腫瘤，飼養(yǎng)時間長，成本高。(2)肝癌發(fā)病率不穩(wěn)定且受到小鼠性別差異的影響。為彌補此類缺陷，研究人員常將病毒HBx基因與細胞癌基因如c-Myc、c-Met等聯(lián)合轉(zhuǎn)基因，或與傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)方法相結(jié)合，以快速制備HBV-HCC小鼠模型并評價病毒-宿主互作在腫瘤發(fā)生中的功能機制[6]。

此外，近年來新出現(xiàn)的一種簡單的肝特異性轉(zhuǎn)基因方法明顯縮短了小鼠模型建立的時間，簡化了相應(yīng)的技術(shù)。該方法通過采用Sleeping Beauty(SB)轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)和基于流體動力學(xué)的轉(zhuǎn)染(hydrodynamic transfection，HT)方法來創(chuàng)建 HBx-轉(zhuǎn)基因模型。SB轉(zhuǎn)座子是一種高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移工具，它能通過“剪切-粘貼”的方式將外源目的基因整合入宿主細胞基因組中[7](圖1)。以SB轉(zhuǎn)座子作為遞送系統(tǒng)，通過流體動力尾靜脈注射將HBx基因整合入Fah-/-/Rag2-/-/Il2rγ-/-(FRG)小鼠的肝細胞中。流體動力傳遞的過程誘導(dǎo)了肝炎癥，隨后攜帶HBx轉(zhuǎn)基因的肝細胞進行選擇性再繁殖，由此證實了單個HBx突變可以誘導(dǎo)肝細胞增殖[8]。HT模型造模時間短是其優(yōu)勢之一，但兩個明顯的缺點在于：編碼癌基因的轉(zhuǎn)座子隨機整合到染色體中，會影響整合位點或附近的細胞基因表達。其次，轉(zhuǎn)座子中的癌基因通常被置于強啟動子的控制之下，因此導(dǎo)致基因以極高的水平表達，不符合人體正常生理機制[9]。

針對HBx轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究發(fā)展迅速，其應(yīng)用也較為廣泛。雖然HBx-Tg的建模成功率高且表型顯著，但其局限性在于小鼠發(fā)生腫瘤之后進展過快，這與人類肝癌的緩慢演變大不相同。第二，小鼠腫瘤往往過于同質(zhì)，無法正確反映人類肝癌的復(fù)雜性。特別是HBx-Tg僅能體現(xiàn)過表達x基因后對肝癌的促進作用，無法反映出完整病毒在自然感染狀態(tài)下的致瘤效應(yīng)。

1.2 基于HBs轉(zhuǎn)基因小鼠的肝癌模型(HBs transgenic mice，HBs-Tg)

HBV S基因所編碼的表面抗原蛋白(HBsAg)也被認為起到促瘤發(fā)生的作用。上個世紀末期，已有報道提示年齡為14～16個月的近半數(shù)HBs轉(zhuǎn)基因小鼠中可檢測到自發(fā)形成的HCC[10]。最近，研究者通過納入CRISPR/Cas9技術(shù)靶向HBV的preS1/preS2和S編碼序列，特異性敲除肝癌細胞系中的HBsAg，功能上進一步證實HBsAg所介導(dǎo)的細胞體外增殖和體內(nèi)成瘤能力被顯著抑制。機制上則闡明HBsAg缺失可導(dǎo)致炎癥通路關(guān)鍵分子白介素IL-6表達量降低，并抑制下游STAT3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化，提示HBsAg參與促發(fā)炎癥是其可能的致瘤機制之一[11]。

HBs-Tg在自然狀態(tài)下持續(xù)表達HBsAg并表現(xiàn)出系統(tǒng)對該抗原的免疫耐受，因此，常應(yīng)用于研究病毒相關(guān)腫瘤的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。據(jù)此，Zong等[12]通過阻斷HBs-Tg小鼠的免疫檢查點受體分子TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)，同時持續(xù)接種乙肝疫苗，觀察到這種聯(lián)合處理所引起的過度免疫反應(yīng)可誘導(dǎo)肝癌發(fā)生。肝癌在9個月齡轉(zhuǎn)基因小鼠中的發(fā)生率可達63.64%，由此建立了新的HBV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的病毒相關(guān)肝癌動物模型。值得注意的是，上述結(jié)果提示在HBV攜帶者中開展免疫檢查點治療，可能增加慢性肝炎和癌癥的發(fā)生風(fēng)險。此外，還有研究人員在免疫系統(tǒng)完全的Fah-/-小鼠肝中通過脾注射轉(zhuǎn)移HBs-Tg小鼠的肝細胞，同樣證實了病毒特異性T細胞的活化是誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝癌的關(guān)鍵因素。該模型在6個月時的腫瘤發(fā)生率為100%，較強的免疫能力使其成為研究抗HBV適應(yīng)性免疫和免疫病理學(xué)的有效工具[13]。而最近一項研究提示，除了細胞殺傷性T細胞外，自然殺傷細胞(natural killer cell，NK cell)被激活亦利于HBs-Tg小鼠發(fā)生肝癌。在該模型小鼠中連續(xù)8周使用自然殺傷細胞激活劑后，下游激活的IFN-γ效應(yīng)分子可通過上調(diào)EpCAM-EMT信號軸使得全部小鼠在6個月后均發(fā)生肝癌[14]。

現(xiàn)有研究成果表明HBs-Tg轉(zhuǎn)基因小鼠是研究病毒相關(guān)HCC的免疫機制和免疫相關(guān)療法的較佳模型。但HBs-Tg與HBx-Tg小鼠具有同樣缺點，即均為單個病毒基因的轉(zhuǎn)基因模型，并且往往需要聯(lián)合其他化學(xué)或物理方法進行協(xié)同干預(yù)，才能快速獲得符合研究需要的肝癌表型。

1.3 基于HBV基因組轉(zhuǎn)染小鼠的肝癌模型(HBV transgenic mice，HBV-Tg)

小鼠肝細胞被證實是可以支持HBV的復(fù)制與增殖，但不支持病毒自然感染和形成 HBV cccDNA[15]。2011年，Huang等[16]應(yīng)用腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus-associated virus，AAV)作為病毒載體，研究HBV在免疫完全小鼠中持續(xù)表達是否可導(dǎo)致HCC。通過靜脈注射AAV荷載的HBV基因組至C57BL/6小鼠中，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)染小鼠在持續(xù)12～16個月后均出現(xiàn)肝腫瘤結(jié)節(jié)，后續(xù)組織病理學(xué)分析提示HCC發(fā)生率為83%。鄰近的癌旁組織也呈現(xiàn)炎癥浸潤、脂肪變性和局灶性壞死等組織學(xué)異常。目前該模型已被廣泛用于揭示HBV病毒復(fù)制和病毒抗原持續(xù)表達對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響(圖1)。

CRISPR/Cas9基因組編輯工具的出現(xiàn)克服了腺病毒作為載體的HBV-Tg小鼠中造模周期長的缺點。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種可以對特定基因組位點進行切割置換的系統(tǒng)[17]。研究者們利用此系統(tǒng)靶向敲除肝癌中關(guān)鍵的細胞抑癌基因，作為輔助手段加速建模過程并研究HBV與宿主分子互作的致瘤機理。但是近年更多是作為新型干預(yù)治療手段嘗試性地用于清除HBV病毒蛋白或基因組，研究對于HBV持續(xù)感染關(guān)鍵分子cccDNA的表達、慢性炎癥乃至肝癌的抑制作用。文獻報道，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)向成年C57-HBV-Tg小鼠肝中同時引入p53和Pten突變，可加速發(fā)生肝癌，最早可提前至注射后4個月。荷瘤小鼠的血清甲胎蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和HBsAg水平顯著高于對照質(zhì)粒組和野生型組[18]。HBV慢性感染的一個治療難點即為患者肝細胞中HBV cccDNA高度穩(wěn)定并難以清除，使得肝和血清中持續(xù)表達病毒相關(guān)分子，它是HBV體內(nèi)復(fù)制和再復(fù)發(fā)的根本原因，因此是預(yù)防繼發(fā)惡性肝病的關(guān)鍵靶點[19]。 Greggi等[20]、Ramanan 等[21]在高壓尾靜脈注射HBV 1.3拷貝的質(zhì)粒所建立的基因組轉(zhuǎn)染小鼠模型中，同時轉(zhuǎn)導(dǎo)可靶向于HBV各基因型間保守序列的24個向?qū)gRNA，結(jié)果顯示病毒表達與復(fù)制及cccDNA水平全部被明顯抑制，提示CRISPR/Cas9可用于體內(nèi)模型研究病毒復(fù)制。但現(xiàn)有數(shù)據(jù)未提示其在病毒相關(guān)肝炎、肝硬化乃至肝癌的三部曲演進過程中的作用，值得長期關(guān)注。盡管目前的CRISPR/Cas9系統(tǒng)已具有強大的靶向性能，但原始的切割式基因編輯方式可能同時誘導(dǎo)細胞基因組雙鏈斷裂從而引發(fā)重排和損傷。與傳統(tǒng)技術(shù)不同，最新發(fā)展出的CRISPR/Cas9通過聯(lián)合使用部分失活的Cas9內(nèi)切酶以及APOBEC脫氨酶，可精準引發(fā)C-T/G-A的堿基轉(zhuǎn)換，但同時避免HBV整合位點的宿主基因斷裂。在充分抑制HBV基因組的同時保護細胞中不出現(xiàn)脫靶突變。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可精準靶向病毒基因組的特性，使其成為將來可能徹底治愈慢性HBV感染和其他肝病的有效辦法[22]。作為病毒學(xué)領(lǐng)域的熱點技術(shù)，CRISPR/Cas9干預(yù)病毒的功能效應(yīng)研究目前主要在體外系統(tǒng)中展開，因此需要納入更多類型體內(nèi)模型予以精準評價[23]。

與單個基因過表達的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠相比，AAV/HBV-Tg小鼠具有易于操作、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。它是在完全免疫小鼠中模擬病毒和宿主互作過程，因此是進一步研究HBV介導(dǎo)慢性肝病和肝癌發(fā)生的分子機制的有效工具。

2 基于異種移植或嵌合的HBV肝癌小鼠模型

2.1 應(yīng)用標準化人肝癌細胞系的小鼠模型(cell line-derived Xenograft，CDX 模型)

目前用于制備人鼠肝嵌合模型的HBV陽性的標準化肝癌細胞系有：HCC LM3細胞、、Hep3B細胞、MHCC97H 細胞、HepG2.2.15細胞、HepAD38等。為成功制備CDX模型，必須滿足兩個條件：(1)受體小鼠對異種移植物具備可容納性，不會產(chǎn)生免疫排斥或其他嚴重不良反應(yīng)；(2)該細胞系在小鼠中具備可成瘤性。

圖1 HBV病毒基因過表達相關(guān)的肝細胞癌小鼠模型Figure 1 Various HBV-related hepatocellular carcinoma mice model by ectopic viral genes or HBV genome

目前CDX模型主要包括皮下移植、腹腔移植和肝內(nèi)原位移植(圖2)。皮下和腹腔移植模型通常是分別將HBV陽性肝癌細胞混懸液注射于小鼠的腹背側(cè)面皮下，或直接至腹腔中。CDX的肝內(nèi)原位模型則通常是先構(gòu)建小鼠皮下腫瘤移植物，然后移植包埋或夾心于小鼠原位肝內(nèi)[24]。最常見和最簡單的模型是皮下移植模型，它可以快速獲得腫瘤組織，這對于研究腫瘤細胞的藥物反應(yīng)或細胞-病毒互作分子機制較為便利[25]，因此，該模型應(yīng)用最廣泛。但是，它不能提供肝癌發(fā)生所需要的各種肝細胞、各種成分相互作用的微環(huán)境，所以原位模型在闡明疾病發(fā)生發(fā)展機制中更具有優(yōu)勢。2019年，Xu等[26]先將HCCLM3細胞懸液皮下注射于五只無胸腺裸小鼠中獲得腫瘤包塊，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。但是再次將組織塊原位接種于小鼠肝左內(nèi)側(cè)葉的囊下區(qū)域時，卻觀察到45%的小鼠出現(xiàn)肝癌骨轉(zhuǎn)移。

在病毒性肝癌的治療策略研究中，抗病毒藥物有效抑制HBV陽性肝癌細胞的增殖提示了抗病毒治療的重要性[27]。研究顯示替比夫定、恩替卡韋和干擾素-α2b等處理可下調(diào)肝癌細胞中HBx表達并抑制細胞增殖，但在恢復(fù)HBx蛋白表達后，三種抗病毒藥物均失去了抗增殖作用，以上提示HBx可能是抗HBV藥物抑制病毒陽性肝癌細胞增殖的主要靶點。

CDX模型均具有技術(shù)簡單、操作時間短、成瘤率高的特點。肝內(nèi)原位移植模型更容易觀察到腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，皮下模型操作最為便利，腹腔模型因其引發(fā)腹腔器官廣泛成瘤現(xiàn)象，現(xiàn)已較少使用。此外，由于培養(yǎng)條件單一，標準化細胞系在長期傳代過程中往往會獲得一些新的永生化表征，且體外培養(yǎng)條件與肝原發(fā)環(huán)境的顯著差異也使得CDX移植物部分丟失原代肝癌細胞的特征。這導(dǎo)致CDX異種移植物缺乏臨床前患者肝癌組織中典型的細胞多樣性和異質(zhì)性，同時因為小鼠基質(zhì)細胞的大量浸潤，CDX模型在病理表現(xiàn)上與人類肝癌相似性較低，使得該模型不常用于藥物篩選和療效評估。

2.2 患者來源的異種移植物模型(patient-derived xenograft，PDX 模型)

與CDX模型相比，病毒性肝癌 PDX小鼠(HBV-HCC PDX)模型的移植物來自HBV陽性的肝細胞癌患者的新鮮腫瘤組織或所分離的原代肝癌細胞(圖2)。該模型克服了永生化肝癌細胞系在多次傳代培養(yǎng)中逐漸丟失腫瘤細胞異質(zhì)性的缺點，表現(xiàn)出更接近患者組織的臨床病毒學(xué)和腫瘤細胞學(xué)特征。

在該模型中，由于免疫缺陷小鼠的異種移植物在荷瘤傳代過程中，其中的人源基質(zhì)細胞逐漸被小鼠來源所替代，因此僅部分保留了患者原始腫瘤的基因表達模式。但其獨特之處是，研究顯示胞外基質(zhì)、細胞黏附分子和免疫通路調(diào)節(jié)分子等基因的表達在移植物中被下調(diào)，而與細胞周期和DNA復(fù)制相關(guān)的基因表達則顯著富集。此外，研究者通過此類皮下模型研究建模過程中HBV抗原表達和定位等病理變化，分析該模型是否可用于腫瘤病毒學(xué)研究[28]。結(jié)果顯示，HBV-HCC PDX模型從宿主和病毒學(xué)兩方面模擬了患者來源肝癌組織的特點，尤其是HBsAg和HBcAg的表達和細胞定位較好重現(xiàn)了其在患者組織中的特點。HBcAg保留了在原始組織中高水平表達且呈胞質(zhì)、胞核和全細胞分布的復(fù)雜模式，HBsAg也再現(xiàn)了患者癌組織中無法檢出的現(xiàn)象。

但是，另有研究者基于7例新加坡HCC病例建立的皮下PDX模型顯示，隨著異種移植物在小鼠體內(nèi)持續(xù)傳代，HBV復(fù)制逐漸丟失[29]。比起皮下模型，肝原位模型更貼合原發(fā)肝癌的腫瘤微環(huán)境。研究者將來自HBV-HCC患者的新鮮腫瘤組織切取為直徑2 mm大小的組織塊并嵌合于無胸腺小鼠的原位肝中，成功制備了原位PDX模型并觀察到廣泛的腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移。免疫組化檢測結(jié)果同樣證實HBx蛋白和人甲胎蛋白保持高表達，說明了原位模型對應(yīng)腫瘤起源的器官保留了必需的微環(huán)境，更能觀察到腫瘤的遠距離廣泛轉(zhuǎn)移[30]。

PDX模型基本保留了原始腫瘤的結(jié)構(gòu)和組織學(xué)特征，因此對于研究腫瘤基因表達模式、突變狀態(tài)、轉(zhuǎn)移潛力和藥物反應(yīng)性等個體化精準醫(yī)學(xué)，它更具有臨床病理學(xué)優(yōu)勢。研發(fā)并完善PDX模型將加速精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展，由于具備和人類原始腫瘤組織高度的相似性，使得該模型可以用于預(yù)測患者個體化抗癌和抗病毒治療的效果[31]。目前HCC PDX模型也已被用于多種藥物的臨床前藥理學(xué)測試[32]。

該模型存在的缺點為：(1)建模需要大量的患者腫瘤資源和大量資金，且技術(shù)要求高、肝原位移植模型死亡率較高；(2)該模型建立在免疫缺陷的小鼠中，仍無法完全模擬腫瘤在人體中的發(fā)生發(fā)展過程，對于肝癌免疫療法和免疫治療藥物研發(fā)具有局限性[33]。因此，有研究人員通過將人類造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)注射入嚴重免疫缺陷(NOD-scid Il2rg-/-，NSG)小鼠中以重建人源免疫系統(tǒng)的模型，并進一步原位移植入I型人白細胞抗原匹配的人肝癌組織，由此建立了免疫完全小鼠的人源肝癌PDX模型[34]。人源免疫小鼠可用以研究腫瘤和免疫應(yīng)答的變化以及免疫檢查點抑制劑的作用，其效應(yīng)可基本還原臨床結(jié)果。該模型更適用于探索病毒介導(dǎo)的人類癌癥與免疫系統(tǒng)之間的相互作用[35]。

3 總結(jié)

圖2 基于異種移植或嵌合的HBV肝細胞癌小鼠模型Figure 2 Xenograft or chimera-based HBV-related hepatocellular carcinoma mice model

雖然HBV病毒相關(guān)肝癌的動物模型類別多種多樣，在腫瘤病毒學(xué)研究領(lǐng)域居于前列，但是目前仍然沒有一種動物模型能夠成為廣泛使用的代表性模型。該領(lǐng)域小鼠模型作為目前最簡便和實惠的選擇，在實驗室中得以普遍使用，但仍存在著一些缺點。轉(zhuǎn)基因小鼠模型僅選擇性在小鼠基因組中插入一個或幾個病毒基因，不能完全擬合HBV正常感染和致病過程中完整病毒各分子間復(fù)雜的時空協(xié)同作用。此外，全基因轉(zhuǎn)染小鼠中則因為小鼠肝細胞不表達HBV感染的功能性受體鈉離子?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)，因此缺乏野生型HBV的自然感染過程。這兩種模型有其優(yōu)勢和特色之處，但在病毒相關(guān)肝癌中的研究還需審慎解釋相關(guān)數(shù)據(jù)。傳統(tǒng)的人源化小鼠因其缺少免疫系統(tǒng)，在研究抗病毒和抗腫瘤免疫治療方面受到極大限制，限制了目前最前沿的免疫治療研究。綜上，現(xiàn)有的病毒相關(guān)肝癌模式動物模型存在其各自優(yōu)缺點和適用范圍，需要我們在實際應(yīng)用中根據(jù)具體目的針對性的選擇使用。同時，為了進一步剖析病毒和腫瘤在免疫學(xué)方面的互作機制，需要我們繼續(xù)研發(fā)能夠完全還原人類免疫系統(tǒng)的病毒相關(guān)肝癌的體內(nèi)模型。建立可真實反映病毒感染和致病特征的體內(nèi)模型，將為研究腫瘤病毒的致病機制提供平臺，具備突出的臨床意義和科學(xué)價值。