莊子銳王明亮張婷蘇鵬亮邵久針印鑫彭蘊(yùn)茹?沈明勤?

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210028；2.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210028)

纖維化可發(fā)于多器官，其實(shí)質(zhì)是慢性損傷長(zhǎng)時(shí)間超出實(shí)質(zhì)細(xì)胞修復(fù)能力，導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞、功能減退，最終臟器硬化和衰竭，目前有效療法只有疾病晚期器官移植[1]。而肝、腎作為人體的兩大免疫和代謝器官，更加容易遭受各種原因的損傷，使得肝腎處于慢性損傷的狀態(tài)。在亞太地區(qū)，每年經(jīng)由纖維化發(fā)展的肝硬化、腎硬化及其并發(fā)癥成為亞太地區(qū)的主要死亡原因之一。因此，慢性肝病和慢性腎病一直都是研究的熱點(diǎn)，對(duì)慢性肝病和慢性腎病的部分機(jī)制、藥物篩選也有詳盡的研究和說(shuō)明，但在實(shí)際臨床中以及在肝、腎纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑦^(guò)程中，肝腎總是在功能和血液動(dòng)力學(xué)方面體現(xiàn)緊密聯(lián)系。除此之外，由于一些傳統(tǒng)中藥的肝腎同治功效需要適宜的動(dòng)物模型來(lái)用進(jìn)行現(xiàn)代科學(xué)研究與闡釋。因此，近年來(lái)逐漸有人嘗試建立一種肝腎纖維化的新復(fù)合模型以適應(yīng)當(dāng)代需求。

作為慢性疾病的早期階段，早期纖維化階段被普遍認(rèn)為具有可逆性，并非不可逆的“疤痕組織”[2]。因此，阻斷早期肝腎纖維化進(jìn)程可以成為治療慢性肝腎疾病新的切入點(diǎn)，使慢性肝腎病在早期階段就有治愈的可能性。目前針對(duì)肝腎纖維化有效的藥物非常有限，因此，能成功建立更加貼近臨床的疾病模型，成為突破阻斷纖維化、逆轉(zhuǎn)肝腎硬化的關(guān)鍵點(diǎn)之一。本文總結(jié)了肝纖維化、腎纖維化和肝腎纖維化復(fù)合模型常用的建立方法，初步探討了模型機(jī)制、對(duì)比了不同方法間的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在為建立更貼近人類(lèi)臨床肝腎纖維化的模型提供參考(見(jiàn)圖1)。

1 肝纖維化模型

1.1 化學(xué)試劑法

多采用四氯化碳、硫代乙酰胺、N-亞硝基化合物等。四氯化碳模型主要以脂肪變性為主，適合于一般肝纖維化的機(jī)制和藥物研究；硫代乙酰胺在體內(nèi)與肝細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)致其壞死，此模型更適合于肝硬化初期階段的研究；N-亞硝基化合物在機(jī)體內(nèi)更依賴(lài)于氧化應(yīng)激反應(yīng)造成損傷。

1.1.1 四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)

四氯化碳(CCl4)為無(wú)色有毒的揮發(fā)性液體，具有令人愉快的氣味，使用過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)注意防止吸入CCl4。因其誘導(dǎo)肝纖維化模型的高復(fù)制性、與人類(lèi)纖維化病理變化的高相似性成為目前應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)藥物。CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的分子機(jī)制現(xiàn)在還尚不完全清楚，但Dong等[3]聯(lián)合利用轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組學(xué)分析和生物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，證實(shí)CCl4毒性主要涉及氧化還原、氧化應(yīng)激反應(yīng)，途徑主要包括視黃醇代謝、花生四烯酸代謝等。

圖1 肝腎纖維化的形成Note.The injury reaction can make the liver and kidney secrete inflammatory factors，activate hepatic stellate cells and promote renal epithelial mesenchymal transition.On the contrary，activation of hepatic stellate cells and epithelial mesenchymal transformation can promote the secretion of inflammatory factors，so that the injury continues，resulting in excessive deposition of extracellular matrix and organ fibrosis.Figure 1 Formation of liver and kidney fibrosis

CCl4通常與玉米油、花生油、橄欖油等按比例混合，通過(guò)灌胃、腹腔注射、吸入、皮下注射等方式給藥。腹腔注射會(huì)造成更高的死亡率，但因建模快、穩(wěn)定性好、成功率高得到更廣泛的應(yīng)用。一般根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系，使用不同劑量CCl4均可在6～8周表現(xiàn)出炎癥因子浸潤(rùn)、肝脂肪變性和壞死的明顯的纖維化階段特征。雌性嚙齒類(lèi)動(dòng)物對(duì)CCl4表現(xiàn)出耐受難成模傾向，所以多數(shù)選取雄性大鼠進(jìn)行造模。此模型具有緩慢形成肝纖維化的變化過(guò)程，形態(tài)學(xué)、病理學(xué)及血清生化指標(biāo)的明顯變化都具有類(lèi)似人類(lèi)肝纖維化的典型特征，適用于肝纖維化形成的動(dòng)態(tài)研究和藥物篩選。

1.1.2 硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)

硫代乙酰胺是無(wú)色或白色結(jié)晶，1948年被報(bào)導(dǎo)具有肝毒性[4]，2017年WHO將其納入2B類(lèi)致癌物。TAA在體內(nèi)和體外均可被CYP 2E1酶激活，代謝為不穩(wěn)定的反應(yīng)物TASO2與肝大分子共價(jià)結(jié)合而引發(fā)壞死。Bashandy等[5]人用TAA誘導(dǎo)肝纖維化時(shí)，腎同時(shí)表現(xiàn)出腎小球縮小、腎小管上皮變性、間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等損傷。

TAA可用蒸餾水或生理鹽水配制，通過(guò)飲用水、腹腔注射等途徑給藥；飲用水給藥可建立比較溫和的肝纖維化模型，但飲用水給藥會(huì)因?yàn)閭€(gè)體攝入差異造成劑量偏差，因此常采用腹腔注射，劑量范圍150～250 mL/kg，最常用劑量200 mg/kg，大概4～6周即可成功建立肝纖維化模型[5-8]。TAA相比CCl4表現(xiàn)出更強(qiáng)肝毒性，造模過(guò)程中更高的死亡率要求實(shí)驗(yàn)人員擴(kuò)大嚙齒類(lèi)動(dòng)物數(shù)量，而集中在中央門(mén)靜脈的病變、與人類(lèi)肝纖維化血流動(dòng)力學(xué)和代謝改變的相似性使其更適合肝纖維化向肝硬化發(fā)展的階段研究。

1.1.3 N-亞硝基化合物

二甲 基 亞 硝 胺/二 乙 基 亞 硝 胺(dimethylnitrosamine/diethylnitrosamine，DMN/DEN)均屬N-亞硝基化合物，在20世紀(jì)30年代先后報(bào)道具有強(qiáng)致癌性與肝毒性。N-亞硝基化合物在各器官主要依靠細(xì)胞色素P450代謝激活，轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘拇x產(chǎn)物，導(dǎo)致烷基化DNA和活性氧產(chǎn)生，從而對(duì)器官產(chǎn)生氧化損傷[9-10]。雖然N-亞硝基化合物的主要損傷靶向器官除肝外還有腎，但其對(duì)腎的損傷研究較為缺乏，研究主要集中于肝毒性。

以肝萎縮、脾腫大、血小板減少和血清總膽紅素水平顯著升高為典型特征的N-亞硝基化合物模型是研究肝纖維化和肝硬化發(fā)展相關(guān)的生化、病理生理以及分子改變的優(yōu)秀動(dòng)物模型。

Dapito等[11]認(rèn)為將DEN與CCl4合用，會(huì)促使腸道產(chǎn)生更多內(nèi)毒素，可更好的模擬人類(lèi)肝癌的微環(huán)境。Ding等[12]利用SD大鼠建立了完整的肝炎-肝纖維化-肝癌模型軸，為不同階段疾病模型的準(zhǔn)確建立提供了參考，此研究顯示每周兩次注射DEN(30 mg/kg)，8～12周肝即處在明顯肝纖維化階段。

1.2 手術(shù)法

肝纖維化手術(shù)法是通過(guò)手術(shù)將膽管暴露并結(jié)扎，直接人為造成膽汁淤積，是一種以膽管增生為病變特點(diǎn)的膽汁淤積型肝纖維化模型。

膽管結(jié)扎可通過(guò)手術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)結(jié)扎膽總管，也可在體外對(duì)細(xì)胞使用抑制劑，造成膽汁阻塞性病變。膽管結(jié)扎一定程度上可較好的模擬人類(lèi)因長(zhǎng)期膽汁淤積而引起的肝細(xì)胞增殖和凋亡、門(mén)靜脈纖維化及肝硬化過(guò)程，以及伴有常見(jiàn)的膽汁性急性腎損傷并發(fā)癥[13-14]。但手術(shù)結(jié)扎會(huì)阻斷所有的膽汁流通，因此，無(wú)法更完全復(fù)制人類(lèi)臨床具有一定膽汁通量的原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽源性膽管炎的病理過(guò)程。

Ghallab等[15]利用熒光膽汁鹽和非膽汁鹽有機(jī)陰離子的雙光子成像技術(shù)對(duì)膽管結(jié)扎的病理機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)扎膽總管后，肝內(nèi)和膽內(nèi)膽汁酸水平急劇升高損傷細(xì)胞。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在膽管結(jié)扎損傷肝中起重要作用[16]。Yang等[17]用SD大鼠結(jié)扎總膽管不同位置進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，膽總管上端結(jié)扎比膽總管中部結(jié)扎可用更小的死亡率誘導(dǎo)更嚴(yán)重的膽汁淤積性肝纖維化。膽管結(jié)扎建模周期大概在2～4周，在7 d左右開(kāi)始看見(jiàn)病理變化，結(jié)扎時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則嚙齒類(lèi)動(dòng)物死亡率會(huì)大幅度升高以致數(shù)據(jù)缺失；手術(shù)法在所有方法中建模最快，但其病變也近似于急性損傷的變化，而纖維化是一種慢性疾病的過(guò)程，因此膽管結(jié)扎可能對(duì)于慢性疾病模型來(lái)說(shuō)不夠典型。

1.3 免疫誘導(dǎo)法

免疫反應(yīng)本是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗外侵的正常反應(yīng)，但大量免疫細(xì)胞和蛋白的堆積又會(huì)損傷正常組織細(xì)胞。免疫誘導(dǎo)法正是利用此原理在嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)模擬人類(lèi)的免疫性纖維化病變，因此，免疫誘導(dǎo)應(yīng)用的前提是作為模型的動(dòng)物源要具有正常免疫系統(tǒng)。

1.3.1 刀豆蛋白(concanavalin A，Con A)

刀豆蛋白是從植物中提取的凝集素，具有強(qiáng)烈的促有絲分裂和促淋巴轉(zhuǎn)化反應(yīng)作用，是重要的生化和免疫研究試劑。Con A誘導(dǎo)的免疫性肝炎模型可用于人類(lèi)免疫性肝炎、急性病毒性肝炎等疾病或藥物篩選的研究。Con A的肝毒性依賴(lài)于激活體內(nèi)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，和內(nèi)皮細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)合，激活自身免疫系統(tǒng)分泌 TNF-α、IFN-γ、TGF-β1等炎癥因子，從而損傷肝細(xì)胞。因此，造模時(shí)不能選用免疫缺陷無(wú)T細(xì)胞應(yīng)答的嚙齒類(lèi)動(dòng)物[18-19]。

本方法建模采用小鼠居多，造模周期約4～8周。造模時(shí)Con A可用生理鹽水或PBS配制，通過(guò)尾靜脈或腹腔注射給藥，關(guān)于劑量Heymann等[20]建議具有更多Th1亞系的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的嚙齒類(lèi)動(dòng)物，例如C57BL/6、C3H小鼠對(duì)刀豆蛋白更加敏感，只需要15～20 mg/kg體重；而具有更多Th2亞系的免疫應(yīng)答嚙齒類(lèi)動(dòng)物，例如BALB/c品系的近交或雜交NMRI小鼠對(duì)刀豆蛋白不敏感則至少需要30 mg/kg體重的量。

1.3.2 豬/牛血清蛋白

血清蛋白是憑借引起自身過(guò)激免疫反應(yīng)產(chǎn)生全身性的損傷，因此本模型更適合于免疫性纖維化病理學(xué)研究，但本模型存在自愈的問(wèn)題。其所致免疫性肝纖維化模型是研究細(xì)胞水平上纖維化隔膜形成的模型，以及肝纖維化后的結(jié)構(gòu)變化，例如毛細(xì)血管化和靜脈化；但目前未見(jiàn)血清蛋白誘導(dǎo)肝腎纖維化復(fù)合模型的誘導(dǎo)研究。

豬/牛血清蛋白無(wú)法在免疫缺陷或免疫耐受?chē)X類(lèi)動(dòng)物中誘導(dǎo)肝纖維化，因其免疫性損傷依賴(lài)于一定周期的激活巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞，釋放炎癥因子，進(jìn)而激活星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞纖維化[21]。用豬血清蛋白誘導(dǎo)的免疫性纖維化程度與血清蛋白劑量并無(wú)依賴(lài)關(guān)系，只會(huì)隨時(shí)間不同呈現(xiàn)不同病理變化[22]。You等[23]用牛血清蛋白(BSA)致SD大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，廣泛的纖維組織增生，纖維組織通過(guò)中央小葉增生并擴(kuò)展為肝實(shí)質(zhì)。

2 腎纖維化模型

2.1 化學(xué)試劑法

重金屬化合物、腺嘌呤和手術(shù)法在國(guó)內(nèi)建立慢性腎病模型的應(yīng)用屬最為廣泛。建立腎纖維化模型的幾種化學(xué)物質(zhì)相較肝纖維化模型的幾種物質(zhì)，明顯缺少對(duì)腎損傷的高度靶向性，且研究多集中于腎的急性損傷研究。

2.1.1 氯化汞(mercury dichloride，HgCl2)

重金屬汞是主要以金屬汞、無(wú)機(jī)汞、有機(jī)汞三種形式普遍存在于自然環(huán)境中的污染物，對(duì)環(huán)境和人體有極大的傷害。腎是受無(wú)機(jī)汞毒性影響的主要器官之一，因?yàn)闊o(wú)機(jī)汞更容易在腎中累計(jì)，使腎成為受傷最嚴(yán)重的器官。

Zalups[24]發(fā)現(xiàn) HgCl2靜脈注射 0.5 μmol/kg或2.0 μmol/kg后3 h，超過(guò)總劑量55%的Hg2+都集中在腎近段小管上皮細(xì)胞中。HgCl2可誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡和破壞細(xì)胞中線粒體膜，當(dāng)線粒體電子傳輸鏈功能受損會(huì)產(chǎn)生過(guò)量活性氧自由基(ROS)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可激活細(xì)胞死亡程序。HgCl2造模時(shí)多選取大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，原因是小鼠對(duì)HgCl2顯示出一定的耐藥性，難成模。本方法可通過(guò)皮下注射、靜脈注射、灌胃等途徑給藥。造模中HgCl2劑量非常關(guān)鍵，過(guò)小難成模，劑量稍大嚙齒類(lèi)動(dòng)物容易大批死亡，因此，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)于大鼠的劑量，應(yīng)多進(jìn)行嘗試或采取梯度給藥。在國(guó)內(nèi)多采用每日8 mg/kg HgCl2水溶液灌胃給藥，8周左右即可建立腎小管間質(zhì)纖維化模型[25]。

2.1.2 腺嘌呤

腺嘌呤可在體內(nèi)代謝為2，8-二羥基腺嘌呤(DHA)，DHA在腎小管積累，形成晶體(結(jié)石)堵塞腎小管造成腎損傷，雖然DHA的致病機(jī)理還尚未完全清楚，但已知TGF-β在其中起到重要作用[26]。

用腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)模型會(huì)增加增加尿酸的排泄，形成蛋白尿，游離氨基酸減少，腎外表顆?；野橛心I纖維化，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能損傷，無(wú)論是緩慢變化的慢性腎病還是并發(fā)癥均與臨床人類(lèi)CKD表現(xiàn)高度一致。

腺嘌呤誘導(dǎo)腎纖維化多采用大鼠進(jìn)行含有0.75%腺嘌呤的飼料喂食，可引起腎迅速且嚴(yán)重的變化，伴隨腎小管損傷、腎小球、腎間質(zhì)纖維化及炎癥。但 Tamura等[26]和 Imamura等[27]僅用含有0.2%和0.25%腺嘌呤飼料喂食C57BL/6小鼠，也成功誘導(dǎo)腎纖維化，可能說(shuō)明小鼠比大鼠對(duì)腺嘌呤更敏感。

2.1.3 硝酸鈾酰(uranyl nitrate)

硝酸鈾酰目前在國(guó)外誘導(dǎo)急性腎損傷模型應(yīng)用較多，其急性腎毒性和急性腎衰竭的病理機(jī)制有很多深入的研究和詳細(xì)的描述。向嚙齒類(lèi)動(dòng)物注射硝酸鈾酰之后，50%的鈾化合物通過(guò)腎排出，鈾化合物在腎中又集中在腎皮質(zhì)部分，在其他器官分布的數(shù)量微不足道，具有較好的腎靶向性[28]。硝酸鈾酰可使嚙齒類(lèi)動(dòng)物尿量和腎小球過(guò)濾率減少，近端腎小管萎縮；其慢性腎毒性多與重金屬汞、鋅等對(duì)腎損傷的機(jī)理類(lèi)似，硝酸鈾酰同樣可以破壞線粒體電子傳輸鏈功能，產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷腎[29]。

在國(guó)內(nèi)不僅對(duì)硝酸鈾酰的慢性腎毒性研究不多，應(yīng)用都非常少，但基于硝酸鈾酰對(duì)腎的靶向性，我們應(yīng)嘗試擴(kuò)大對(duì)硝酸鈾酰的慢性腎毒性研究，也許可以建立良好的慢性腎纖維化模型。在為數(shù)不多的硝酸鈾酰誘導(dǎo)纖維化模型文章中，多采用雌性嚙齒類(lèi)動(dòng)物，硝酸鈾酰的給藥方式和劑量都比較統(tǒng)一，多采用單次腹腔注射5 mg硝酸鈾酰/kg體重，大約8～10周即可見(jiàn)腎間質(zhì)纖維化。

2.2 手術(shù)法

對(duì)腎纖維化的研究中更多會(huì)采取手術(shù)法建立模型，一般手術(shù)法有單側(cè)輸尿管結(jié)扎、5/6腎切除手術(shù)和缺血再灌注法；其中結(jié)扎單側(cè)輸尿管最經(jīng)典，應(yīng)用也是最為廣泛，而缺血再灌注法則因其臨床實(shí)際應(yīng)用的高度需求性同樣被研究的較多。5/6腎切除法雖然也能快速建立腎的損傷，但因其需要切除大部分腎，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生過(guò)大的損傷且并不是很符合臨床需求的研究。

2.2.1 單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral ligation，UUO)

本方法適用于大鼠和小鼠，輸尿管結(jié)扎后阻礙尿液正常排泄，短時(shí)間便可造成尿潴留，腎腫大，腎小管細(xì)胞壞死，腎組織結(jié)構(gòu)完全被破壞從而導(dǎo)致腎功能不全。此模型已經(jīng)成為了研究尿路梗阻腎小管間質(zhì)纖維化原因和機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)模型。但UUO模型同樣存在慢性病變特點(diǎn)不夠典型的問(wèn)題，并且伴隨結(jié)扎時(shí)間延長(zhǎng)，嚙齒類(lèi)動(dòng)物死亡率會(huì)加速提升。此模型病變只發(fā)生在結(jié)扎輸尿管一側(cè)，對(duì)側(cè)腎功能依舊正常。

單側(cè)輸尿管結(jié)扎后，從第3天起有腎髓質(zhì)和皮質(zhì)減少的病理變化，且有少量纖維化出現(xiàn)，隨時(shí)間推移，結(jié)扎7 d后血清肌酐和尿素氮成倍增長(zhǎng)，單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，部分近端小管上皮空泡變性[30]，兩周后即可形成以小管細(xì)胞壞死和萎縮、炎癥細(xì)胞滲透、細(xì)胞外基質(zhì)和I型膠原蛋白大量沉積為特點(diǎn)的嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)破壞[31]。劉克劍等[32]等發(fā)現(xiàn)從側(cè)腹開(kāi)口結(jié)扎單側(cè)輸尿管兩端后，不離斷輸尿管，可保證不影響造模效果的同時(shí)大幅提升嚙齒類(lèi)動(dòng)物的存活率。

2.2.2 缺血再灌注

在臨床的外科手術(shù)、器官移植、燒傷等過(guò)程均可出現(xiàn)缺血再灌注損傷，然而短暫缺血并不足以引起器官細(xì)胞損傷，反而缺血后的血液再灌注可造成微血管和實(shí)質(zhì)細(xì)胞更嚴(yán)重的損傷。因此缺血再灌注模型具有高度應(yīng)用局限性，基本全部用于缺血再灌注引起腎損傷的相關(guān)研究。

缺血再灌注引起的腎損傷主要與活性氧自由基和Ca2+超載有關(guān)，在缺血組織中清除自由基的酶類(lèi)合成能力受損，并且缺血再灌注可以直接損傷腎小球內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，抑制TLR4通路和增強(qiáng)清除自由基能力可減少缺血再灌注造成的損傷[33]。張蕊[34]利用動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)MRI監(jiān)測(cè)大鼠缺血再灌注后的腎損傷，發(fā)現(xiàn)當(dāng)大鼠腎缺血30～45 min時(shí)可在保證大鼠存活率的條件下對(duì)腎造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

3 肝腎纖維化復(fù)合模型

作為人體兩大免疫器官，肝腎總是有千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，不僅臨床上的肝腎綜合征、乙肝相關(guān)性腎病、膽汁性腎病等，中醫(yī)的腎病從肝論治，肝病從腎論治等均體現(xiàn)著肝腎協(xié)作、互滋的能力；此外，為了深入研究一些傳統(tǒng)中藥對(duì)肝腎的異病同治功效，開(kāi)始嘗試建立肝腎纖維化復(fù)合模型?；谝酝⒏卫w維化和腎纖維化模型的經(jīng)驗(yàn)之上，幾乎所有肝損傷藥物和手術(shù)法都具有高度肝靶向性的同時(shí)可輕損腎，而致腎損傷的化學(xué)藥物往往腎靶向性較低，因此在建立肝腎纖維化復(fù)合模型時(shí)多采用肝靶向性損傷藥物結(jié)合腎損傷藥物或直接采用能造成全身?yè)p傷的化學(xué)試劑、藥物。

3.1 四氯化碳和牛血清

Manoj[35]聯(lián)合四氯化碳和牛血清蛋白腹腔注射。在本研究中，四氯化碳主要造成肝損傷，牛血清蛋白主要通過(guò)免疫復(fù)合物形成蛋白尿造成腎損傷；10周后肝病理切片可見(jiàn)明顯的纖維化，腎僅見(jiàn)結(jié)締組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

四氯化碳具有較高肝靶向性的同時(shí)對(duì)腎也有損傷，牛血清蛋白作為免疫性損傷藥物配合四氯化碳，使肝腎損傷程度均大致處于纖維化階段，但本試驗(yàn)最終并未顯示嚴(yán)重的腎纖維化結(jié)果；反而發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白對(duì)四氯化碳的肝損傷有拮抗作用，為日后造模方法提供了新發(fā)現(xiàn)。

3.2 DMN和汞

姜哲浩等[36]在研究扶正化瘀方對(duì)大鼠肝腎纖維化的影響時(shí)采用了腹腔注射DMN和喂食含有重金屬汞的飼料建立肝腎纖維化復(fù)合模型。8周之后，肝組織壞死、肝細(xì)胞腫脹、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、假小葉形成；腎間質(zhì)水腫伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎間質(zhì)中大量膠原纖維。汞在誘導(dǎo)腎纖維化單獨(dú)使用時(shí)，劑量難以控制，但配合對(duì)肝腎都有損傷的DMN使用大大提高了成功誘導(dǎo)肝腎纖維化的幾率。

3.3 酪氨酸氧化產(chǎn)物

酪氨酸是常見(jiàn)的食品添加劑和藥原料，容易被氧化修飾[37]；因此在售賣(mài)的牛奶、奶粉、動(dòng)物飼料中等均可檢測(cè)到酪氨酸及其氧化產(chǎn)物的存在。因此，酪氨酸及其氧化產(chǎn)物對(duì)人體的影響成為了研究熱點(diǎn)。李竹青[38]發(fā)現(xiàn)短期28 d喂食酪氨酸氧化產(chǎn)物可對(duì)肝腎均產(chǎn)生損傷，隨喂食時(shí)間增長(zhǎng)，會(huì)引起肝腎炎癥因子大量分泌，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，緊接著激活肝星狀細(xì)胞與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，引起肝腎纖維化。

3.4 環(huán)孢菌素A(cyclosporine，CsA)

從20世紀(jì)80年代CsA作為免疫抑制劑應(yīng)用于臨床，主要用于器官移植手術(shù)后的排異反應(yīng)，但由于較嚴(yán)重的肝、腎毒性副作用，使其應(yīng)用受限。短期注射CsA可使腎血流減少，長(zhǎng)期注射會(huì)導(dǎo)致具有廣泛的腎小管纖維化的腎衰竭。CsA的急性腎毒性與激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)有關(guān)，慢性腎毒性是因?yàn)榭捎|發(fā)機(jī)體分泌TGF-β，大量的TGF-β是觸發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。CsA可破壞腎近端管狀細(xì)胞的形態(tài)、連接結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架，并且在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，成肌纖維細(xì)胞可以自由遷移到間質(zhì)中，并釋放出大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，促進(jìn)纖維化發(fā)展[30-40]。程根陽(yáng)[41]先建立低鹽飲食(low salt diet，LSD)喂養(yǎng)，然后每日皮下注射CsA，14 d后即顯示肝腎功能受損、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，35 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，纖維化程度明顯。

4 總結(jié)與展望

4.1 總結(jié)

現(xiàn)有建立肝、腎纖維化模型的方法在建模難易程度、臨床相似性、重復(fù)程度都各有千秋。化學(xué)誘導(dǎo)法建模耗時(shí)較長(zhǎng)，但比較符合慢性疾病病變過(guò)程，個(gè)別毒性化學(xué)物質(zhì)，如氯化汞、DMN等由于安全管控原因難以購(gòu)買(mǎi)，因此模型出現(xiàn)空缺，丞待開(kāi)發(fā)新的模型；手術(shù)法雖然建模過(guò)程耗時(shí)短，但對(duì)于慢性疾病的慢性病變過(guò)程來(lái)講不夠典型，同時(shí)術(shù)后感染、嚙齒類(lèi)動(dòng)物撕咬造成刀口撕裂、結(jié)扎時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等使死亡率升高；免疫法雖能引起全身性的炎癥，但卻存在停藥后可自愈的問(wèn)題，這并不利于肝腎纖維化的治療藥物篩選。

現(xiàn)有造模方法基本可以實(shí)現(xiàn)從不同發(fā)病原因來(lái)模擬人類(lèi)臨床中出現(xiàn)的肝、腎纖維化的一些病理變化，可以適用于不同科研目的。相對(duì)來(lái)講肝腎纖維化復(fù)合模型現(xiàn)在處于較空白的階段，由于膽管結(jié)扎、注射硫代乙酰胺等方法能同時(shí)引起肝腎的損傷，是對(duì)肝腎同時(shí)的直接毒性還是基于肝腎功能交互的損傷，對(duì)其潛在機(jī)制及誘導(dǎo)復(fù)合模型的潛力還有待深入研究。近年僅有兩篇報(bào)道稱(chēng)酪氨酸氧化產(chǎn)物和環(huán)孢菌素A均可同時(shí)引起肝腎纖維化，但在大鼠體內(nèi)引起的病理變化及模型特點(diǎn)還需進(jìn)行大量且深入的研究；而能夠引起全身性損傷的阿霉素和免疫性血清可能成為誘導(dǎo)肝腎纖維化復(fù)合模型的潛力物質(zhì)；同時(shí)也可以嘗試分別選取建立肝纖維化和腎纖維化模型的經(jīng)典方法，結(jié)合使用建立肝腎纖維化復(fù)合模型，例如經(jīng)典四氯化碳模型、硫代乙酰胺模型結(jié)合單側(cè)輸尿管結(jié)扎法等。

4.2 展望

人類(lèi)慢性肝病和慢性腎病作為全球健康問(wèn)題，其藥物研究日益迫切。而實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型不僅可以從群體數(shù)量上滿(mǎn)足疾病實(shí)驗(yàn)和藥物篩選實(shí)驗(yàn)的要求，還可以在實(shí)驗(yàn)中各個(gè)環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)條件控制，可以人為的剔除一些干擾因素，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)病機(jī)制、疾病進(jìn)程、藥物篩選等進(jìn)行深入的研究。但現(xiàn)有的肝、腎纖維化動(dòng)物模型依舊存在問(wèn)題：(1)對(duì)動(dòng)物模型本身的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚；(2)肝腎纖維化動(dòng)物模型大多在大、小鼠身上建立，模型的動(dòng)物種類(lèi)較少；(3)無(wú)法完全模擬人類(lèi)肝、腎纖維化進(jìn)展所引起的所有變化；(4)造模過(guò)程中死亡的嚙齒類(lèi)動(dòng)物無(wú)法確認(rèn)死因，且可能會(huì)在嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)并發(fā)癥或其他變化我們也無(wú)法詳盡得知；(5)造模過(guò)程至今并未有統(tǒng)一化的規(guī)范操作標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)因?yàn)閲X類(lèi)動(dòng)物品種、實(shí)驗(yàn)人員操作、藥品配置等方面造成成模差異。

因此，對(duì)現(xiàn)有建模方法繼續(xù)優(yōu)化以及對(duì)所有動(dòng)物模型進(jìn)行發(fā)病機(jī)制的探討，都將是日后重點(diǎn)研究的領(lǐng)域。