彭亮楊鵬劉沖楊金豐馬三輝

(定州市人民醫(yī)院骨科，河北定州 073000)

踝關(guān)節(jié)骨折是臨床上常見(jiàn)的手足創(chuàng)傷疾病，鈣和維生素(Ca/VitD)缺乏可能是影響創(chuàng)傷后骨折愈合的重要因素[1]。VitD通過(guò)影響腸鈣吸收、腎鈣再吸收和破骨細(xì)胞骨吸收來(lái)調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)[2]。VitD缺乏和低鈣供應(yīng)都會(huì)通過(guò)骨吸收增加而維持血液中的鈣，從而降低骨量和質(zhì)量[3]。此外，Ca/VitD缺乏癥也可能導(dǎo)致踝關(guān)節(jié)骨折患者中常見(jiàn)的骨折愈合并發(fā)癥[4]，因?yàn)殁}對(duì)骨折-愈傷組織礦化是必不可少的。但是目前Ca/VitD在手足創(chuàng)傷踝關(guān)節(jié)骨折愈合中的作用仍未得到很好的研究，補(bǔ)充Ca/VitD是否有助于手足創(chuàng)傷骨折愈合也存在爭(zhēng)議[5]。最近，有團(tuán)隊(duì)研究了由次氯酸鈉引起的鈣吸收不良的大鼠骨折愈合，發(fā)現(xiàn)骨折后骨愈合不受影響，而骨骼破骨細(xì)胞活性顯著增加[6]。這些結(jié)果表明，當(dāng)骨吸收不符合愈傷組織礦化的要求時(shí)，創(chuàng)傷后骨吸收增強(qiáng)。與此結(jié)果一致，臨床研究中觀察到骨折后全身骨丟失，其表現(xiàn)為骨密度(BMD)降低高達(dá)15%[7]。創(chuàng)傷后骨丟失可顯著增加繼發(fā)性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此得出假設(shè)，創(chuàng)傷后骨丟失可能在Ca/VitD缺乏的情況下發(fā)生，然而目前缺乏相關(guān)研究。

因此，本研究采用手足創(chuàng)傷踝關(guān)節(jié)骨折大鼠模型，研究飲食中Ca/VitD缺乏是否會(huì)損害骨修復(fù)。此外還探討了從踝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始在飲食中補(bǔ)充Ca/VitD對(duì)Ca/VitD缺乏飲食者破骨細(xì)胞活性和骨量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只清潔級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體重約為220 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2015-0004】。飼養(yǎng)于定州市人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(冀)2015-0018】。飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水，提供足夠飼料。飼養(yǎng)環(huán)境：濕度恒定，溫度控制在22～25℃。所有操作均符合定州市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)要求(審批號(hào)：DZPH-DW2018003)。

1.1.2 主要試劑與儀器

RNAlaterTM(Sigma-Aldrich)，大鼠抗小鼠FGF23(MAB26291，R＆D Systems Inc，美國(guó))，兔抗小鼠FGFR1/CD331(PA5-25979， Invitrogen， Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，生物素偶聯(lián)的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(B2770，Invitrogen，美國(guó))和生物素偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG(A10517，Invitrogen，美國(guó))。

高分辨率臺(tái)式CT(Skyscan 1172，比利時(shí))，倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，IX73，日本)，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，TP600 型 PCR 儀(TaKaRa，日本)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將大鼠隨機(jī)分為三組。對(duì)照組C組標(biāo)準(zhǔn)喂食(Ca 0.5%，VitD 2000 IU/kg)，而D組和S組則接受Ca/VitD缺乏飲食(Ca 0.25%，VitD 0 IU/kg)。8周后，所有大鼠均接受手術(shù)構(gòu)建大鼠手足創(chuàng)傷踝關(guān)節(jié)骨折模型。手術(shù)后立即將S組轉(zhuǎn)入補(bǔ)充Ca/VitD的飲食(Ca 2.0%，VitD 2000 IU/kg)。第10天和第23天處死大鼠(n＝8)，并評(píng)估手足創(chuàng)傷術(shù)后踝關(guān)節(jié)骨折愈合情況。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.2.2 手術(shù)

踝關(guān)節(jié)骨折手術(shù)采用2%異氟烷全麻下進(jìn)行。為了鎮(zhèn)痛，大鼠在手術(shù)前1 d至術(shù)后3 d飲用水中加入25 mg/mL鹽酸曲馬多。手術(shù)前，所有大鼠均皮下注射抗生素克林霉素-2-二氫磷酸酯(45 mg/kg)。對(duì)踝關(guān)節(jié)進(jìn)行無(wú)菌處理后，將大鼠仰臥臥位，右側(cè)髖關(guān)節(jié)外展90°。右膝關(guān)節(jié)彎曲90°。然后在內(nèi)踝處做1 cm縱行切口，鈍性分離皮下筋膜及肌腱，暴露內(nèi)踝。小骨鑿與角度固定器(37°)組合后置于脛骨遠(yuǎn)端，中等力度將骨鑿敲入內(nèi)踝，然后采用縫線縫合，術(shù)后允許其自由活動(dòng)。

1.2.3 血清分析

在給予手術(shù)創(chuàng)傷時(shí)(眼眶取血)和實(shí)施安樂(lè)死當(dāng)天(心臟穿刺)獲得大鼠血液樣本。I型膠原C端端肽(CTX)、I型前膠原N端肽(PINP)、甲狀旁腺激素(PTH)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(iFGF23，完整和C末端)血清水平采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒測(cè)定。

1.2.4 微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(μCT)分析

在第23天，采用μCT掃描設(shè)備以8 μm的分辨率，50 kV的電壓和200 μA的電壓對(duì)踝關(guān)節(jié)進(jìn)行成像。使用μCT圖像在兩個(gè)垂直平面上評(píng)估了每個(gè)愈傷組織橋接皮質(zhì)的數(shù)量。當(dāng)觀察到每個(gè)愈傷組織≥3個(gè)橋接皮質(zhì)時(shí)，該骨折被認(rèn)為“已成功治愈”。

1.2.5 組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和免疫組化

將第10、23天的踝關(guān)節(jié)植入甲基丙烯酸甲酯或石蠟中。采用番紅O染色法進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，用圖像分析軟件測(cè)定整個(gè)愈傷組織中骨、軟骨和纖維組織的相對(duì)數(shù)量。第23天采用抗酒石酸磷酸酶染色后，根據(jù)ASBMR指南評(píng)估骨細(xì)胞參數(shù)[9]。利用圖像分析軟件，在踝關(guān)節(jié)骨折愈傷組織中間1.8 mm×0.9 mm區(qū)域進(jìn)行成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用抗體和稀釋液對(duì)踝關(guān)節(jié)(D23)的石蠟包埋切片進(jìn)行FGF23和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(FGFR1)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.6 骨折愈傷組織的基因表達(dá)分析

在第23天，收集踝關(guān)節(jié)愈傷組織并在4℃下儲(chǔ)存在RNAlater中。去除RNAlater后，將斷裂愈傷組織在液氮中快速冷凍，并在振動(dòng)磨中以30 Hz的頻率粉碎1.5 min。采用試劑盒分離總RNA，將1 μg分離的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)。引物序列如下：堿性磷酸酶(ALP，F(xiàn)： 5′-GCTGATCATTCCCACACTTTT-3′和 R： 5′-GAGCCAGACCAAAGATGGAG-3′)，維生素 D 受體(VDR，F(xiàn)：5′-GGGCTTCCACTTCAACGCTA-3′和 R：5′-CATGCTCCGCCTGAAGAAAC-3′)，X 連鎖磷酸鹽調(diào) 節(jié) 基 因 (Phex， F： 5′-TTCCCCAGAGTTTGAC TGGCTG-3′和 R： 5′-TCTCCGAGGGACCAATGTCT-3′)， FGF23(F： 5′-ACAGGAGCCATGACTCGAAG-3′和 R：5′- 將 GCAATTCTCTGGGCTGAAGT-3′) 和FGFR1(F：5′-TGACGACGACGATGACTCCT-3′和 R：5′-AGCTACAGGCCTACGGTTTG-3′)，管家基因 β-2-微球蛋白(F：5′-ATACGCCTGCAGAGTTAAGCA-3′和R：5′-TCACATGTCTCGATCCCAGT-3′)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用GraphPad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及分析。數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()。當(dāng)三組相互比較時(shí)，通過(guò)單因素方差分析(ANOVA)和事后Fishers LSD分析數(shù)據(jù)的顯著性，采用t檢驗(yàn)比較兩組樣本的顯著性。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析骨折愈合數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 手足創(chuàng)傷前大鼠血清及μCT分析結(jié)果

手足創(chuàng)傷前在未骨折(D組和S組)大鼠和對(duì)照組(C組)大鼠之間，血清、μCT和組織形態(tài)學(xué)參數(shù)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)(表1)。

2.2 飲食中Ca/VitD缺乏對(duì)骨折愈合的影響

為評(píng)估Ca/VitD缺乏飲食對(duì)大鼠手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈合的影響。創(chuàng)傷后第10天，未觀察到Ca/VitD缺乏對(duì)愈傷組織的顯著影響。到第23天，與C組大鼠相比，D組大鼠的骨折愈傷組織中的BMD顯著降低(P＜0.05)，BV/TV沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，而在組織形態(tài)計(jì)量學(xué)中，D組大鼠在新形成的愈傷組織中骨量顯著減少(P＜0.001)，纖維組織量顯著增加(P＜0.05)(見(jiàn)表2，圖1A，1B)，而在骨折的愈傷組織中，D組大鼠破骨細(xì)胞的數(shù)量和表面顯著增加(P＜0.01)，D組的成骨細(xì)胞活性沒(méi)有顯著性差異(圖1C)。這些結(jié)果表明在D組大鼠中骨含量略有減少，說(shuō)明在Ca/VitD缺乏飲食組中手足創(chuàng)傷術(shù)后骨愈合受到了中度干擾。

2.3 飲食中Ca/VitD補(bǔ)充對(duì)骨折愈合的影響

Ca/VitD補(bǔ)充劑S組在骨折后10 d無(wú)明顯影響。到第23天，S組在踝關(guān)節(jié)愈傷組織中的BMD略有增加，但沒(méi)有顯著增加。與D組相比，S組大鼠的愈傷組織中的骨量顯著增加(P＜0.01)，而纖維組織部分顯著減少(P＜0.05)。此外，S組表現(xiàn)出較高的骨折愈合率(P＜0.05)(表3)。

與D組相比，手足創(chuàng)傷術(shù)后23 d，S組大鼠的骨痂成骨細(xì)胞標(biāo)志物ALP mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，血清PTH水平顯著降低(P＜0.001)，和C組相比骨吸收標(biāo)記物CTX的血清水平降低，但骨形成標(biāo)記PINP的血清水平差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。這些結(jié)果表明，在手足創(chuàng)傷術(shù)后開(kāi)始的Ca/VitD補(bǔ)充減少甚至補(bǔ)償了慢性Ca/VitD缺乏的負(fù)面影響(表3)。

與此同時(shí)，S組iFGF23及cFGF23的血清水平均顯著升高，與D組，C組相比較具有顯著性差異(P＜0.05)。但iFGF23：cFGF23三組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)說(shuō)明飲食中補(bǔ)充Ca/VitD對(duì)骨折愈傷組織中的iFGF23，cFGF23表達(dá)水平具有關(guān)聯(lián)性。與D組的相比，S組中 Phex mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，證實(shí)了FGF23運(yùn)轉(zhuǎn)率提高，見(jiàn)表3。

表1 手足創(chuàng)傷前大鼠μCT及血清分析結(jié)果(n＝8)Table 1 CT and serum analysis results of rats before hand and foot trauma(n＝8)

表2 創(chuàng)傷后第23天大鼠骨折愈傷組織μCT分析結(jié)果(n＝8)Table 2 CT analysis of callus of rat fracture on day 23 after trauma(n＝8)

表3 骨折后第23天大鼠骨折愈合參數(shù)及血清分析結(jié)果(n＝8)Table 3 Fracture healing parameters and serum analysis results of rats on 23 d after fracture(n＝8)

圖1 大鼠踝關(guān)節(jié)的組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果Note.A.Percentage of bone， cartilage and fibrous tissue in the fracture callus at 10 d.B.Percentage of bone， cartilage and fibrous tissue in fracture callus at 23 d.C.Ankle callus stained with safflower O and tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP).Figure 1 Histomorphological analysis results of rat ankle joint

3 討論

本研究研究了Ca/VitD在手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈合中的作用。慢性膳食Ca/VitD缺乏大鼠踝關(guān)節(jié)骨折后血清PTH水平明顯升高，破骨細(xì)胞活性增加。踝關(guān)節(jié)骨折創(chuàng)傷術(shù)后補(bǔ)充Ca/VitD可促進(jìn)愈合。因此，本研究證明了在手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈合過(guò)程中充足的Ca/VitD的供應(yīng)可減少Ca/VitD缺乏飲食者破骨細(xì)胞活性和增加骨量，改善骨修復(fù)，在臨床上具有高度的相關(guān)性。

由于鈣在骨再生過(guò)程中對(duì)愈傷組織礦化至關(guān)重要，因此，本研究研究了Ca/VitD缺乏是否影響骨修復(fù)。D組表現(xiàn)出中等程度的骨折愈合，骨折愈傷組織中骨含量減少及破骨細(xì)胞數(shù)量增加。D組的PTH水平高可能是愈傷組織中破骨細(xì)胞活性顯著增加的原因。關(guān)于Ca/VitD缺乏對(duì)骨愈合的影響，目前對(duì)大鼠的研究數(shù)量有限，已有少量研究報(bào)道了對(duì)愈傷組織礦化和生物力學(xué)骨特性的相互矛盾的影響[10-11]。與本研究結(jié)果一致，愈合受損和不愈合的患者與正常愈合的患者相比，血清維生素D水平較低[12]。此外，本研究證明了補(bǔ)充Ca/VitD可以消除先前缺乏飲食的負(fù)面影響，這一點(diǎn)可以通過(guò)骨折愈傷組織中骨量增加得到證明。

VitD對(duì)骨再生的積極作用主要是通過(guò)其對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)的內(nèi)分泌作用間接發(fā)揮作用，從而增加骨折愈傷組織礦化的鈣供應(yīng)。然而，維生素D對(duì)骨骼的直接影響也被廣泛討論，因?yàn)槌晒羌?xì)胞表達(dá)VDR，其在這些細(xì)胞上的表達(dá)直接受生物活性1，25(OH)2D3調(diào)控[13]。體外研究表明1，25(OH)2D3和VDR可增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和礦化，表現(xiàn)為成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物ALP活性增加[14]。本研究證明了補(bǔ)充Ca/VitD大鼠手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈傷組織中VDR和ALP的表達(dá)增加?；谶@些結(jié)果，可以說(shuō)明增強(qiáng)的1，25(OH)2D3/VDR信號(hào)在骨折愈傷組織中的局部作用可能也有助于Ca/VitD治療誘導(dǎo)的骨折愈合改善。然而，需要進(jìn)一步的研究探討其確切機(jī)制。

此外，本研究還研究了FGF23，是礦物質(zhì)和VitD代謝的調(diào)節(jié)劑，對(duì)有效的骨愈合非常重要。在S組大鼠中，iFGF23和cFGF23血清水平均顯著增加，表明FGF23周轉(zhuǎn)率提高。但是，iFGF23：cFGF23的比例未改變，可能表明其生物活性FGF23不變。與此一致，骨折愈傷組織中的FGF23和FGFR1表達(dá)不受Ca/VitD補(bǔ)充的影響，表明局部FGF23信號(hào)不受影響。骨折愈傷組織中的內(nèi)肽酶Phex mRNA表達(dá)增加，表明FGF23裂解支持大鼠中FGF23更新。但是，需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

總之，本研究表明，Ca/VitD補(bǔ)充劑在踝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷術(shù)后可減少Ca/VitD缺乏飲食者破骨細(xì)胞活性和增加骨量，改善骨修復(fù)，可減少患者發(fā)生繼發(fā)性骨折的風(fēng)險(xiǎn)。