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        低溫治療后不同復(fù)溫速率對(duì)心搏驟停復(fù)蘇大鼠神經(jīng)元自噬的影響

        2021-01-14 11:24:18孫大偉崔德榮
        關(guān)鍵詞:心搏氯喹溶酶體

        李 藝,胡 月,孫大偉,崔德榮

        上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院麻醉科,上海 200233

        心搏驟停發(fā)病率高,存活率低;且復(fù)蘇成功后,易遺留神經(jīng)功能障礙,致殘率高[1]。心搏驟停患者自主循環(huán)恢復(fù)可造成腦缺血再灌注后6 h 內(nèi),鈣離子超載,大量炎癥因子、氧自由基和毒性神經(jīng)遞質(zhì)釋放,這是患者神經(jīng)元損傷的主要原因。低溫治療被美國(guó)心臟協(xié)會(huì)推薦為心搏驟停患者自主循環(huán)恢復(fù)后的常規(guī)治療方法[2]。研究結(jié)果[3-4]表明,心搏驟?;颊咦灾餮h(huán)恢復(fù)后將患者溫度降至32 ~36 ℃并持續(xù)24 ~48 h,進(jìn)而慢速?gòu)?fù)溫后,患者的神經(jīng)功能預(yù)后與生存率顯著高于常溫組。其主要作用機(jī)制包括降低腦氧耗、減少炎癥因子釋放、抑制氧自由基生成、減少毒性神經(jīng)遞質(zhì)釋放等[5-6]。

        低溫過(guò)程包括誘導(dǎo)期、維持期和復(fù)溫期,其中復(fù)溫期是低溫治療過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。有研究[7]表明,低溫治療后慢速?gòu)?fù)溫可避免顱內(nèi)壓增高;而快速?gòu)?fù)溫引起炎癥因子白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)、IL-10 升高,逆轉(zhuǎn)低溫治療效果,降低生存率[7-9]。探索低溫治療后不同復(fù)溫速率所涉及的分子機(jī)制對(duì)減少低溫治療并發(fā)癥、改善患者預(yù)后、推廣低溫治療臨床應(yīng)用具有重要意義。

        既往研究[10-11]表明腦缺血再灌注可過(guò)度激活自噬,導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。自噬既是細(xì)胞的一種死亡機(jī)制,也是細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制[12]。自噬過(guò)程中自噬小體形成后,包裹待降解物質(zhì)運(yùn)送至溶酶體,溶酶體降解自噬小體,產(chǎn)生小分子代謝物,該過(guò)程也稱為自噬流。其中溶酶體起著重要的作用,其功能異常可導(dǎo)致多種疾病,如溶酶體儲(chǔ)存病等[13]。本課題組既往研究[14]結(jié)果表明,未經(jīng)低溫治療的SD 大鼠腦缺血再灌注損傷后,氧自由基產(chǎn)生增加,自噬激活和溶酶體功能障礙,表現(xiàn)為溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)以及溶酶體水解酶組織蛋白酶D(cathepsin D)表達(dá)量降低、自噬流受損,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。另有研究[10]表明,心搏驟停復(fù)蘇后的低溫治療可抑制自噬過(guò)度激活,對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)性作用,但目前關(guān)于低溫治療過(guò)程中不同復(fù)溫速率所涉及的具體分子機(jī)制尚不明確。本研究旨在通過(guò)觀察自噬以及溶酶體功能在低溫治療后復(fù)溫過(guò)程中的變化,揭示該過(guò)程中所涉及的具體分子機(jī)制,從而改進(jìn)低溫治療方案,為低溫臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),提高目標(biāo)體溫管理治療在臨床上的使用率。

        1 對(duì)象與方法

        1.1 研究對(duì)象

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)SD 大鼠,2 ~3 月齡,體質(zhì)量250 ~350 g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005。大鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK (滬) 2011-0128。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作流程符合上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3- Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3- Ⅱ,LC3- Ⅱ)抗體、P62 抗體、LAMP2 抗體、cathepsin D 抗體、熒光二抗Alexa Fluor?488 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司,Beclin1(Bcl 2- interacting protein-1)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司,泛素蛋白u(yù)biquitin 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司,β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自中國(guó)杭州華安生物技術(shù)有限公司,化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑、RIPA蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司,Triton X-100 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司,苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、鹽酸氯喹、尼式染色液、蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。亞低溫治療儀購(gòu)自中國(guó)眾實(shí)迪創(chuàng)公司,鼠機(jī)械通氣儀購(gòu)自美國(guó)哈佛儀器公司,化學(xué)發(fā)光成像儀(Image-Quant LAS 4000)購(gòu)自美國(guó)GE 公司,倒置熒光顯微鏡(DM IL LED)購(gòu)自德國(guó)Leica 公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 動(dòng)物模型的建立 建立SD 大鼠窒息性心搏驟停復(fù)蘇模型,取SD 大鼠80 只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(15 只)、常溫組(15 只)、慢速?gòu)?fù)溫組(30 只)和快速?gòu)?fù)溫組(20只)。使用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,進(jìn)行左側(cè)股動(dòng)脈、右側(cè)股靜脈置管和氣管插管,并連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠肛門溫度和動(dòng)脈血壓變化。假手術(shù)組同樣進(jìn)行上述手術(shù)準(zhǔn)備步驟,但無(wú)心搏驟停復(fù)蘇處理。常溫組、慢速?gòu)?fù)溫組、快速?gòu)?fù)溫組于右側(cè)股靜脈注射肌肉松弛劑羅庫(kù)溴銨(2 mg/kg),使自主呼吸停止持續(xù)5 min 且平均動(dòng)脈壓下降至25 mmHg 以下持續(xù)2 ~3 min 后,立刻進(jìn)行機(jī)械通氣、胸外心臟按壓并靜脈注射腎上腺素(100 μg/kg)。自主循環(huán)恢復(fù)后,常溫組使用加熱板,維持體溫(37.0±0.5) ℃;慢速?gòu)?fù)溫組和快速?gòu)?fù)溫組即刻進(jìn)行34 ℃持續(xù)4 h 的低溫治療,低溫治療以及后續(xù)的復(fù)溫都是通過(guò)亞低溫治療儀進(jìn)行,該設(shè)備可監(jiān)測(cè)并自動(dòng)調(diào)節(jié)直腸溫度至設(shè)定點(diǎn)。隨后,慢速?gòu)?fù)溫組以0.5 ℃ /h 復(fù)溫,快速?gòu)?fù)溫組以4 ℃ /h 復(fù)溫至(37.0±0.5) ℃。慢速?gòu)?fù)溫組和快速?gòu)?fù)溫組的SD 大鼠中各隨機(jī)選取5 只,作為慢速?gòu)?fù)溫氯喹組和快速?gòu)?fù)溫氯喹組,于建模前1 h 腹腔注射氯喹10 mg/kg。

        1.2.2 尼式染色 用于尼氏染色的SD 大鼠,在低溫治療結(jié)束后24 h 取材,每組5 只。冰凍切片室溫放置30 min后,蒸餾水洗滌2 次(每次2 min),尼式染料滴于腦片上,于37 ℃孵育10 min 后,蒸餾水洗滌2 次,依次使用95%、70%乙醇脫水,二甲苯通透5 min,封片,顯微鏡下拍片。每只大鼠取3 張切片,每張切片在大腦皮質(zhì)區(qū)域隨機(jī)取5個(gè)視野(400 倍鏡下),計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野下活細(xì)胞數(shù)目。正常神經(jīng)元的尼氏小體呈藍(lán)紫色,體積大而數(shù)量多,神經(jīng)元受損時(shí)細(xì)胞皺縮,尼氏小體呈藍(lán)色,數(shù)量減少甚至消失。

        1.2.3 Western blotting 蛋白檢測(cè) 假手術(shù)組、常溫組、快速?gòu)?fù)溫組于低溫治療結(jié)束后6 h 取材,每組5 只;慢速?gòu)?fù)溫組于低溫治療結(jié)束后6、12、24 h 取材,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,使用0.9%生理鹽水經(jīng)心臟灌注,取出腦組織并置于冰上取下雙側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層M1、M2 區(qū)。將取下的腦組織與PMSF、蛋白酶抑制劑混勻以后使用研磨器研磨。研磨物于4 ℃下12 000×g離心20 min,取上清液,使用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,PVDF 膜洗滌后加入抗P62(1:2 000)、抗Beclin1(1:2 000)、抗LC3- Ⅱ(1:3 000)、抗LAMP2(1:500)、抗cathepsin D(1:1 000)、抗ubiquitin(1:1 000)的一抗,于4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日,室溫二抗孵育1 h 后,于PVDF 膜上覆蓋化學(xué)發(fā)光顯影劑曝光。采用Image J 對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行灰度值分析。

        1.2.4 免疫熒光檢測(cè) 在低溫治療結(jié)束后12 h 取材,每組5 只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,使用0.9%生理鹽水經(jīng)心臟灌注,繼而用4%多聚甲醛持續(xù)灌注后取腦組織。置入濃度為20%~30%的蔗糖溶液依次梯度脫水后,浸泡于4%多聚甲醛固定24 h,于-80 ℃保存。使用OGD 包埋液包裹腦組織,于-20 ℃冰凍切片,厚度約20 μm,貼于載玻片上,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        將制備好的冰凍切片室溫放置30 min 后,磷酸鹽緩沖液洗滌10 min,重復(fù)3 次。5%胎牛血清室溫封閉1 h后,使用0.25% Triton X-100 室溫破膜10 min,隨后加入抗LAMP2(1:200)、抗LC3- Ⅱ(1:100)的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。次日,磷酸鹽緩沖液清洗,熒光二抗室溫孵育1 h,核酸染料4', 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)室溫10 min 染細(xì)胞核,于倒置熒光顯微鏡下觀察拍片。每只大鼠取3 張切片,每張切片在大腦皮質(zhì)區(qū)域隨機(jī)取5 個(gè)視野(400 倍鏡下),觀察陽(yáng)性蛋白的熒光強(qiáng)度。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        應(yīng)用SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0 以及Adobe Photoshop CC 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖形制作。定量資料以±s 表示,采用單因素方差分析,Bonferroni 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同復(fù)溫速率對(duì)神經(jīng)元活性的影響

        為觀察窒息性心搏驟停復(fù)蘇低溫治療后,不同復(fù)溫速率對(duì)大鼠神經(jīng)元活性的影響,使用尼氏染色檢測(cè)低溫治療結(jié)束后24 h 大鼠運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元的改變。檢測(cè)結(jié)果(圖1) 顯示,快速?gòu)?fù)溫組運(yùn)動(dòng)皮層活細(xì)胞數(shù)為每個(gè)高倍鏡(×400)視野下(22.0±2.5)個(gè),慢速?gòu)?fù)溫組為每個(gè)高倍鏡(×400)視野下(55.0±4.2)個(gè),快速?gòu)?fù)溫組神經(jīng)元活細(xì)胞數(shù)顯著低于慢速?gòu)?fù)溫組(P<0.05),且與常溫組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        圖1 不同復(fù)溫組大鼠運(yùn)動(dòng)皮層尼式染色Fig 1 Nissl staining of rat motor cortex in different rewarming groups

        2.2 慢速?gòu)?fù)溫對(duì)自噬的影響

        為觀察復(fù)溫對(duì)自噬的影響,使用Western blotting 測(cè)定慢速?gòu)?fù)溫組低溫治療后6、12、24 h 的自噬激活標(biāo)志蛋白LC3- Ⅱ與Beclin1 的蛋白表達(dá)量。結(jié)果(圖2A)顯示,與假手術(shù)組和常溫組比較,6 h 和12 h 后,LC3- Ⅱ以及Beclin1 水平增高。自噬選擇性底物受體P62,能夠識(shí)別待降解物,并將其運(yùn)送到自噬溶酶體。P62 表達(dá)水平在6 h檢測(cè)到最低,且低于假手術(shù)組和常溫組。進(jìn)一步使用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞LC3- Ⅱ的表達(dá)情況,結(jié)果(圖2B)顯示慢速?gòu)?fù)溫過(guò)程中,LC3- Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)較假手術(shù)組和常溫組顯著增加,以上結(jié)果表明在慢速?gòu)?fù)溫過(guò)程中自噬激活且自噬流通暢。

        圖2 慢速?gòu)?fù)溫過(guò)程中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig 2 Expression of autophagy associated proteins during slow rewarming

        2.3 不同復(fù)溫速率對(duì)溶酶體功能的影響

        為進(jìn)一步觀察不同復(fù)溫速率對(duì)溶酶體功能的影響,我們檢測(cè)了不同復(fù)溫組低溫治療結(jié)束后6 h 溶酶體相關(guān)蛋白LAMP2 和cathepsin D 的表達(dá)水平。Western blotting 結(jié)果(圖3)顯示,與假手術(shù)組和慢速?gòu)?fù)溫組相比,常溫組和快速?gòu)?fù)溫組LAMP2 和cathepsin D 的表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),常溫組和快速?gòu)?fù)溫組蛋白表達(dá)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用免疫熒光法檢測(cè)溶酶體LAMP2 在皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達(dá),結(jié)果顯示,與慢速?gòu)?fù)溫組相比,快速?gòu)?fù)溫組LAMP2 陽(yáng)性細(xì)胞率降低,與常溫組無(wú)明顯差異。以上結(jié)果說(shuō)明低溫治療后快速?gòu)?fù)溫導(dǎo)致大腦皮質(zhì)神經(jīng)元溶酶體功能發(fā)生障礙,并且與常溫組無(wú)明顯 差異。

        2.4 不同復(fù)溫速率對(duì)自噬流的影響

        自噬受體蛋白P62 以及泛素蛋白u(yù)biquitin 是反映自噬通量的關(guān)鍵蛋白。氯喹可抑制溶酶體水解酶活性,進(jìn)而使自噬流受損,其常作為檢測(cè)自噬流受損的陽(yáng)性對(duì)照物。對(duì)復(fù)溫組大鼠增加氯喹處理,可進(jìn)一步觀察溶酶體功能障礙對(duì)慢速和快速?gòu)?fù)溫過(guò)程中自噬流的影響。結(jié)果(圖4)顯示,與慢速?gòu)?fù)溫組(未注射氯喹)相比較,慢速?gòu)?fù)溫氯喹組P62 和ubiquitin 表達(dá)水平在低溫治療結(jié)束后6 h 顯著增加,提示慢速?gòu)?fù)溫組自噬流通暢。但快速?gòu)?fù)溫氯喹組較快速?gòu)?fù)溫組(未注射氯喹),P62 和ubiquitin 表達(dá)水平顯著降低,表明快速?gòu)?fù)溫組溶酶體功能障礙且自噬流受損。

        圖3 不同復(fù)溫組溶酶體相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig 3 Expression of lysosomal-related proteins in different rewarming groups

        圖4 不同復(fù)溫速率對(duì)自噬流的影響Fig 4 Effect of different rewarming rates on autophagy flux

        3 討論

        研究[3]表明,34 ~36 ℃持續(xù)24 h 的全身性低溫治療能顯著提高心搏驟停后心肺復(fù)蘇患者的存活率和改善神經(jīng)功能預(yù)后。但對(duì)部分心搏驟停的患者,低溫對(duì)患者結(jié)局并無(wú)顯著效果,且由于低溫治療本身帶來(lái)的不良反應(yīng)[15],如心率減慢、血壓降低、凝血功能異常等,致使低溫治療在臨床上的使用率低。復(fù)溫是患者體溫從持續(xù)低溫治療恢復(fù)到常溫的過(guò)程,是低溫治療過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。另有研究[8,16]報(bào)道,盡管低溫治療可改善患者心功能、神經(jīng)功能及提高生存率,但復(fù)溫過(guò)程可誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡且快速?gòu)?fù)溫(2 ℃ /h)可逆轉(zhuǎn)低溫治療對(duì)心肌及腦組織的保護(hù)性作用。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一現(xiàn)象,尼式染色結(jié)果提示快速?gòu)?fù)溫組活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于慢速?gòu)?fù)溫組。關(guān)于復(fù)溫階段,不同的溫度變異度對(duì)細(xì)胞生理功能如何產(chǎn)生影響,其中涉及的分子機(jī)制是什么,目前尚未闡明。

        自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體對(duì)損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器吞噬降解并釋放小分子物質(zhì)供機(jī)體使用的過(guò)程。自噬過(guò)程包括自噬小體形成、自噬小體包裹待降解物運(yùn)送至溶酶體、溶酶體與自噬體相結(jié)合、內(nèi)容物降解及釋放的過(guò)程。其中Beclin1 作為上游信號(hào)分子調(diào)控自噬膜的形成;LC3- Ⅰ作為其下游信號(hào)分子,在形成雙層膜結(jié)構(gòu)過(guò)程中與磷脂酰乙醇胺(PE)連接,形成LC3- Ⅱ,此標(biāo)志著自噬的起始[17]。根據(jù)本課題組既往研究[14],心搏驟停復(fù)蘇后未使用低溫治療的SD 大鼠溶酶體功能障礙自噬流受損,導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡,本研究進(jìn)一步探索這一機(jī)制在腦缺血再灌注-低溫治療-復(fù)溫過(guò)程中所扮演的角色。結(jié)果顯示,慢速?gòu)?fù)溫組LC3- Ⅱ和Beclin1 均在低溫治療結(jié)束后6 h 升高,且在12 h 時(shí)仍顯著高于常溫組,同時(shí)伴隨自噬受體蛋白P62 的降低,提示復(fù)溫過(guò)程中自噬激活且自噬流通暢,推測(cè)低溫治療聯(lián)合慢速?gòu)?fù)溫對(duì)未使用低溫治療組的自噬流受損有修復(fù)作用,這一機(jī)制與低溫治療提高神經(jīng)元活力相一致。

        溶酶體在自噬過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用,其功能的完整性對(duì)于自噬小體的降解至關(guān)重要[18]。研究[19]表明,溶酶體功能障礙導(dǎo)致溶酶體儲(chǔ)存病,引起機(jī)體一系列病理生理改變。溶酶體蛋白水解酶cathepsin D 的活性,反映著溶酶體的功能;溶酶體膜蛋白LAMP2 反映著溶酶體數(shù)量的多少[20]。本研究結(jié)果檢測(cè)到快速?gòu)?fù)溫組較慢速?gòu)?fù)溫組LAMP2 和cathepsin D 表達(dá)量均降低,提示快速?gòu)?fù)溫組溶酶體功能異常。這一生物事件的發(fā)生與快速?gòu)?fù)溫組神經(jīng)元的死亡率增加相一致。由于快速和慢速?gòu)?fù)溫組之間的差異僅為復(fù)溫過(guò)程中溫度升高速率不同,推測(cè)低溫治療后的急劇溫度變化可能引起組織代謝和耗氧量增加,氧化應(yīng)激加重,最終導(dǎo)致溶酶體功能障礙,神經(jīng)元死亡。但目前復(fù)溫過(guò)程中相關(guān)的機(jī)制研究較少,確切的分子機(jī)制尚不明確。

        在自噬過(guò)程中,泛素化待降解蛋白質(zhì)是將其運(yùn)送至溶酶體前的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。泛素蛋白量的變化反映著自噬通量的變化。本研究中慢速?gòu)?fù)溫組使用氯喹抑制溶酶體蛋白水解酶活性,泛素蛋白及P62 進(jìn)一步增加,提示自噬流通暢。而快速?gòu)?fù)溫組使用氯喹處理后,泛素蛋白及P62 表達(dá)水平未進(jìn)一步增加,反而有下降的趨勢(shì),提示自噬流受損。結(jié)合本研究中快速?gòu)?fù)溫組神經(jīng)元損傷與常溫組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,推測(cè)快速?gòu)?fù)溫過(guò)程中自噬流受損,逆轉(zhuǎn)了低溫治療的保護(hù)性作用。

        低溫治療可降低細(xì)胞氧耗,減少氧化應(yīng)激及炎癥因子產(chǎn)生,最終抑制腦缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫治療后的慢速?gòu)?fù)溫對(duì)于保持低溫治療的有效性至關(guān)重要,而快速?gòu)?fù)溫可逆轉(zhuǎn)低溫治療的效果;本研究還初步探討了快速?gòu)?fù)溫逆轉(zhuǎn)低溫治療效果的潛在機(jī)制,即溶酶體功能障礙,自噬流受損,為臨床上改進(jìn)低溫治療措施、改善患者預(yù)后提供了理論基礎(chǔ);但其涉及的其他分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

        參·考·文·獻(xiàn)

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