李 藝，胡 月，孫大偉，崔德榮

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海 200233

心搏驟停發(fā)病率高，存活率低；且復(fù)蘇成功后，易遺留神經(jīng)功能障礙，致殘率高[1]。心搏驟?；颊咦灾餮h(huán)恢復(fù)可造成腦缺血再灌注后6 h 內(nèi)，鈣離子超載，大量炎癥因子、氧自由基和毒性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，這是患者神經(jīng)元損傷的主要原因。低溫治療被美國心臟協(xié)會推薦為心搏驟?；颊咦灾餮h(huán)恢復(fù)后的常規(guī)治療方法[2]。研究結(jié)果[3-4]表明，心搏驟?；颊咦灾餮h(huán)恢復(fù)后將患者溫度降至32 ～36 ℃并持續(xù)24 ～48 h，進(jìn)而慢速復(fù)溫后，患者的神經(jīng)功能預(yù)后與生存率顯著高于常溫組。其主要作用機制包括降低腦氧耗、減少炎癥因子釋放、抑制氧自由基生成、減少毒性神經(jīng)遞質(zhì)釋放等[5-6]。

低溫過程包括誘導(dǎo)期、維持期和復(fù)溫期，其中復(fù)溫期是低溫治療過程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。有研究[7]表明，低溫治療后慢速復(fù)溫可避免顱內(nèi)壓增高；而快速復(fù)溫引起炎癥因子白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-10 升高，逆轉(zhuǎn)低溫治療效果，降低生存率[7-9]。探索低溫治療后不同復(fù)溫速率所涉及的分子機制對減少低溫治療并發(fā)癥、改善患者預(yù)后、推廣低溫治療臨床應(yīng)用具有重要意義。

既往研究[10-11]表明腦缺血再灌注可過度激活自噬，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。自噬既是細(xì)胞的一種死亡機制，也是細(xì)胞的一種保護(hù)性機制[12]。自噬過程中自噬小體形成后，包裹待降解物質(zhì)運送至溶酶體，溶酶體降解自噬小體，產(chǎn)生小分子代謝物，該過程也稱為自噬流。其中溶酶體起著重要的作用，其功能異?？蓪?dǎo)致多種疾病，如溶酶體儲存病等[13]。本課題組既往研究[14]結(jié)果表明，未經(jīng)低溫治療的SD 大鼠腦缺血再灌注損傷后，氧自由基產(chǎn)生增加，自噬激活和溶酶體功能障礙，表現(xiàn)為溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosome-associated membrane protein 2，LAMP2）以及溶酶體水解酶組織蛋白酶D（cathepsin D）表達(dá)量降低、自噬流受損，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。另有研究[10]表明，心搏驟停復(fù)蘇后的低溫治療可抑制自噬過度激活，對神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)性作用，但目前關(guān)于低溫治療過程中不同復(fù)溫速率所涉及的具體分子機制尚不明確。本研究旨在通過觀察自噬以及溶酶體功能在低溫治療后復(fù)溫過程中的變化，揭示該過程中所涉及的具體分子機制，從而改進(jìn)低溫治療方案，為低溫臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，提高目標(biāo)體溫管理治療在臨床上的使用率。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物 雄性SPF 級SD 大鼠，2 ～3 月齡，體質(zhì)量250 ～350 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005。大鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號為SYXK （滬） 2011-0128。所有實驗動物操作流程符合上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 實驗試劑和儀器 微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3- Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3- Ⅱ，LC3- Ⅱ）抗體、P62 抗體、LAMP2 抗體、cathepsin D 抗體、熒光二抗Alexa Fluor?488 購自英國Abcam 公司，Beclin1（Bcl 2- interacting protein-1）抗體購自美國Santa Cruz 公司，泛素蛋白ubiquitin 抗體購自美國CST 公司，β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自中國杭州華安生物技術(shù)有限公司，化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑、RIPA蛋白裂解液購自美國Thermo Fisher 公司，Triton X-100 購自美國Sigma 公司，苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、鹽酸氯喹、尼式染色液、蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。亞低溫治療儀購自中國眾實迪創(chuàng)公司，鼠機械通氣儀購自美國哈佛儀器公司，化學(xué)發(fā)光成像儀（Image-Quant LAS 4000）購自美國GE 公司，倒置熒光顯微鏡（DM IL LED）購自德國Leica 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 建立SD 大鼠窒息性心搏驟停復(fù)蘇模型，取SD 大鼠80 只，隨機分為假手術(shù)組（15 只）、常溫組（15 只）、慢速復(fù)溫組（30 只）和快速復(fù)溫組（20只）。使用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，進(jìn)行左側(cè)股動脈、右側(cè)股靜脈置管和氣管插管，并連續(xù)監(jiān)測大鼠肛門溫度和動脈血壓變化。假手術(shù)組同樣進(jìn)行上述手術(shù)準(zhǔn)備步驟，但無心搏驟停復(fù)蘇處理。常溫組、慢速復(fù)溫組、快速復(fù)溫組于右側(cè)股靜脈注射肌肉松弛劑羅庫溴銨（2 mg/kg），使自主呼吸停止持續(xù)5 min 且平均動脈壓下降至25 mmHg 以下持續(xù)2 ～3 min 后，立刻進(jìn)行機械通氣、胸外心臟按壓并靜脈注射腎上腺素（100 μg/kg）。自主循環(huán)恢復(fù)后，常溫組使用加熱板，維持體溫（37.0±0.5） ℃；慢速復(fù)溫組和快速復(fù)溫組即刻進(jìn)行34 ℃持續(xù)4 h 的低溫治療，低溫治療以及后續(xù)的復(fù)溫都是通過亞低溫治療儀進(jìn)行，該設(shè)備可監(jiān)測并自動調(diào)節(jié)直腸溫度至設(shè)定點。隨后，慢速復(fù)溫組以0.5 ℃ /h 復(fù)溫，快速復(fù)溫組以4 ℃ /h 復(fù)溫至（37.0±0.5） ℃。慢速復(fù)溫組和快速復(fù)溫組的SD 大鼠中各隨機選取5 只，作為慢速復(fù)溫氯喹組和快速復(fù)溫氯喹組，于建模前1 h 腹腔注射氯喹10 mg/kg。

1.2.2 尼式染色 用于尼氏染色的SD 大鼠，在低溫治療結(jié)束后24 h 取材，每組5 只。冰凍切片室溫放置30 min后，蒸餾水洗滌2 次（每次2 min），尼式染料滴于腦片上，于37 ℃孵育10 min 后，蒸餾水洗滌2 次，依次使用95%、70%乙醇脫水，二甲苯通透5 min，封片，顯微鏡下拍片。每只大鼠取3 張切片，每張切片在大腦皮質(zhì)區(qū)域隨機取5個視野（400 倍鏡下），計算每個高倍鏡視野下活細(xì)胞數(shù)目。正常神經(jīng)元的尼氏小體呈藍(lán)紫色，體積大而數(shù)量多，神經(jīng)元受損時細(xì)胞皺縮，尼氏小體呈藍(lán)色，數(shù)量減少甚至消失。

1.2.3 Western blotting 蛋白檢測 假手術(shù)組、常溫組、快速復(fù)溫組于低溫治療結(jié)束后6 h 取材，每組5 只；慢速復(fù)溫組于低溫治療結(jié)束后6、12、24 h 取材，每個時間點5只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，使用0.9%生理鹽水經(jīng)心臟灌注，取出腦組織并置于冰上取下雙側(cè)運動皮層M1、M2 區(qū)。將取下的腦組織與PMSF、蛋白酶抑制劑混勻以后使用研磨器研磨。研磨物于4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清液，使用BCA 法檢測蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PVDF 膜洗滌后加入抗P62（1:2 000）、抗Beclin1（1:2 000）、抗LC3- Ⅱ（1:3 000）、抗LAMP2（1:500）、抗cathepsin D（1:1 000）、抗ubiquitin（1:1 000）的一抗，于4 ℃搖床孵育過夜。次日，室溫二抗孵育1 h 后，于PVDF 膜上覆蓋化學(xué)發(fā)光顯影劑曝光。采用Image J 對免疫印跡條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4 免疫熒光檢測 在低溫治療結(jié)束后12 h 取材，每組5 只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，使用0.9%生理鹽水經(jīng)心臟灌注，繼而用4%多聚甲醛持續(xù)灌注后取腦組織。置入濃度為20%～30%的蔗糖溶液依次梯度脫水后，浸泡于4%多聚甲醛固定24 h，于-80 ℃保存。使用OGD 包埋液包裹腦組織，于-20 ℃冰凍切片，厚度約20 μm，貼于載玻片上，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將制備好的冰凍切片室溫放置30 min 后，磷酸鹽緩沖液洗滌10 min，重復(fù)3 次。5%胎牛血清室溫封閉1 h后，使用0.25% Triton X-100 室溫破膜10 min，隨后加入抗LAMP2（1:200）、抗LC3- Ⅱ（1:100）的一抗，4 ℃孵育過夜。次日，磷酸鹽緩沖液清洗，熒光二抗室溫孵育1 h，核酸染料4', 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫10 min 染細(xì)胞核，于倒置熒光顯微鏡下觀察拍片。每只大鼠取3 張切片，每張切片在大腦皮質(zhì)區(qū)域隨機取5 個視野（400 倍鏡下），觀察陽性蛋白的熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0 以及Adobe Photoshop CC 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖形制作。定量資料以±s 表示，采用單因素方差分析，Bonferroni 檢驗進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同復(fù)溫速率對神經(jīng)元活性的影響

為觀察窒息性心搏驟停復(fù)蘇低溫治療后，不同復(fù)溫速率對大鼠神經(jīng)元活性的影響，使用尼氏染色檢測低溫治療結(jié)束后24 h 大鼠運動皮層神經(jīng)元的改變。檢測結(jié)果（圖1） 顯示，快速復(fù)溫組運動皮層活細(xì)胞數(shù)為每個高倍鏡（×400）視野下（22.0±2.5）個，慢速復(fù)溫組為每個高倍鏡（×400）視野下（55.0±4.2）個，快速復(fù)溫組神經(jīng)元活細(xì)胞數(shù)顯著低于慢速復(fù)溫組（P＜0.05），且與常溫組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 不同復(fù)溫組大鼠運動皮層尼式染色Fig 1 Nissl staining of rat motor cortex in different rewarming groups

2.2 慢速復(fù)溫對自噬的影響

為觀察復(fù)溫對自噬的影響，使用Western blotting 測定慢速復(fù)溫組低溫治療后6、12、24 h 的自噬激活標(biāo)志蛋白LC3- Ⅱ與Beclin1 的蛋白表達(dá)量。結(jié)果（圖2A）顯示，與假手術(shù)組和常溫組比較，6 h 和12 h 后，LC3- Ⅱ以及Beclin1 水平增高。自噬選擇性底物受體P62，能夠識別待降解物，并將其運送到自噬溶酶體。P62 表達(dá)水平在6 h檢測到最低，且低于假手術(shù)組和常溫組。進(jìn)一步使用免疫熒光法檢測細(xì)胞LC3- Ⅱ的表達(dá)情況，結(jié)果（圖2B）顯示慢速復(fù)溫過程中，LC3- Ⅱ陽性細(xì)胞計數(shù)較假手術(shù)組和常溫組顯著增加，以上結(jié)果表明在慢速復(fù)溫過程中自噬激活且自噬流通暢。

圖2 慢速復(fù)溫過程中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig 2 Expression of autophagy associated proteins during slow rewarming

2.3 不同復(fù)溫速率對溶酶體功能的影響

為進(jìn)一步觀察不同復(fù)溫速率對溶酶體功能的影響，我們檢測了不同復(fù)溫組低溫治療結(jié)束后6 h 溶酶體相關(guān)蛋白LAMP2 和cathepsin D 的表達(dá)水平。Western blotting 結(jié)果（圖3）顯示，與假手術(shù)組和慢速復(fù)溫組相比，常溫組和快速復(fù)溫組LAMP2 和cathepsin D 的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），常溫組和快速復(fù)溫組蛋白表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。使用免疫熒光法檢測溶酶體LAMP2 在皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與慢速復(fù)溫組相比，快速復(fù)溫組LAMP2 陽性細(xì)胞率降低，與常溫組無明顯差異。以上結(jié)果說明低溫治療后快速復(fù)溫導(dǎo)致大腦皮質(zhì)神經(jīng)元溶酶體功能發(fā)生障礙，并且與常溫組無明顯 差異。

2.4 不同復(fù)溫速率對自噬流的影響

自噬受體蛋白P62 以及泛素蛋白ubiquitin 是反映自噬通量的關(guān)鍵蛋白。氯喹可抑制溶酶體水解酶活性，進(jìn)而使自噬流受損，其常作為檢測自噬流受損的陽性對照物。對復(fù)溫組大鼠增加氯喹處理，可進(jìn)一步觀察溶酶體功能障礙對慢速和快速復(fù)溫過程中自噬流的影響。結(jié)果（圖4）顯示，與慢速復(fù)溫組（未注射氯喹）相比較，慢速復(fù)溫氯喹組P62 和ubiquitin 表達(dá)水平在低溫治療結(jié)束后6 h 顯著增加，提示慢速復(fù)溫組自噬流通暢。但快速復(fù)溫氯喹組較快速復(fù)溫組（未注射氯喹），P62 和ubiquitin 表達(dá)水平顯著降低，表明快速復(fù)溫組溶酶體功能障礙且自噬流受損。

圖3 不同復(fù)溫組溶酶體相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig 3 Expression of lysosomal-related proteins in different rewarming groups

圖4 不同復(fù)溫速率對自噬流的影響Fig 4 Effect of different rewarming rates on autophagy flux

3 討論

研究[3]表明，34 ～36 ℃持續(xù)24 h 的全身性低溫治療能顯著提高心搏驟停后心肺復(fù)蘇患者的存活率和改善神經(jīng)功能預(yù)后。但對部分心搏驟停的患者，低溫對患者結(jié)局并無顯著效果，且由于低溫治療本身帶來的不良反應(yīng)[15]，如心率減慢、血壓降低、凝血功能異常等，致使低溫治療在臨床上的使用率低。復(fù)溫是患者體溫從持續(xù)低溫治療恢復(fù)到常溫的過程，是低溫治療過程中的一個關(guān)鍵步驟。另有研究[8,16]報道，盡管低溫治療可改善患者心功能、神經(jīng)功能及提高生存率，但復(fù)溫過程可誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡且快速復(fù)溫（2 ℃ /h）可逆轉(zhuǎn)低溫治療對心肌及腦組織的保護(hù)性作用。本研究結(jié)果也證實了這一現(xiàn)象，尼式染色結(jié)果提示快速復(fù)溫組活細(xì)胞計數(shù)顯著低于慢速復(fù)溫組。關(guān)于復(fù)溫階段，不同的溫度變異度對細(xì)胞生理功能如何產(chǎn)生影響，其中涉及的分子機制是什么，目前尚未闡明。

自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體對損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器吞噬降解并釋放小分子物質(zhì)供機體使用的過程。自噬過程包括自噬小體形成、自噬小體包裹待降解物運送至溶酶體、溶酶體與自噬體相結(jié)合、內(nèi)容物降解及釋放的過程。其中Beclin1 作為上游信號分子調(diào)控自噬膜的形成；LC3- Ⅰ作為其下游信號分子，在形成雙層膜結(jié)構(gòu)過程中與磷脂酰乙醇胺（PE）連接，形成LC3- Ⅱ，此標(biāo)志著自噬的起始[17]。根據(jù)本課題組既往研究[14]，心搏驟停復(fù)蘇后未使用低溫治療的SD 大鼠溶酶體功能障礙自噬流受損，導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，本研究進(jìn)一步探索這一機制在腦缺血再灌注-低溫治療-復(fù)溫過程中所扮演的角色。結(jié)果顯示，慢速復(fù)溫組LC3- Ⅱ和Beclin1 均在低溫治療結(jié)束后6 h 升高，且在12 h 時仍顯著高于常溫組，同時伴隨自噬受體蛋白P62 的降低，提示復(fù)溫過程中自噬激活且自噬流通暢，推測低溫治療聯(lián)合慢速復(fù)溫對未使用低溫治療組的自噬流受損有修復(fù)作用，這一機制與低溫治療提高神經(jīng)元活力相一致。

溶酶體在自噬過程中起到關(guān)鍵性作用，其功能的完整性對于自噬小體的降解至關(guān)重要[18]。研究[19]表明，溶酶體功能障礙導(dǎo)致溶酶體儲存病，引起機體一系列病理生理改變。溶酶體蛋白水解酶cathepsin D 的活性，反映著溶酶體的功能；溶酶體膜蛋白LAMP2 反映著溶酶體數(shù)量的多少[20]。本研究結(jié)果檢測到快速復(fù)溫組較慢速復(fù)溫組LAMP2 和cathepsin D 表達(dá)量均降低，提示快速復(fù)溫組溶酶體功能異常。這一生物事件的發(fā)生與快速復(fù)溫組神經(jīng)元的死亡率增加相一致。由于快速和慢速復(fù)溫組之間的差異僅為復(fù)溫過程中溫度升高速率不同，推測低溫治療后的急劇溫度變化可能引起組織代謝和耗氧量增加，氧化應(yīng)激加重，最終導(dǎo)致溶酶體功能障礙，神經(jīng)元死亡。但目前復(fù)溫過程中相關(guān)的機制研究較少，確切的分子機制尚不明確。

在自噬過程中，泛素化待降解蛋白質(zhì)是將其運送至溶酶體前的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。泛素蛋白量的變化反映著自噬通量的變化。本研究中慢速復(fù)溫組使用氯喹抑制溶酶體蛋白水解酶活性，泛素蛋白及P62 進(jìn)一步增加，提示自噬流通暢。而快速復(fù)溫組使用氯喹處理后，泛素蛋白及P62 表達(dá)水平未進(jìn)一步增加，反而有下降的趨勢，提示自噬流受損。結(jié)合本研究中快速復(fù)溫組神經(jīng)元損傷與常溫組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測快速復(fù)溫過程中自噬流受損，逆轉(zhuǎn)了低溫治療的保護(hù)性作用。

低溫治療可降低細(xì)胞氧耗，減少氧化應(yīng)激及炎癥因子產(chǎn)生，最終抑制腦缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫治療后的慢速復(fù)溫對于保持低溫治療的有效性至關(guān)重要，而快速復(fù)溫可逆轉(zhuǎn)低溫治療的效果；本研究還初步探討了快速復(fù)溫逆轉(zhuǎn)低溫治療效果的潛在機制，即溶酶體功能障礙，自噬流受損，為臨床上改進(jìn)低溫治療措施、改善患者預(yù)后提供了理論基礎(chǔ)；但其涉及的其他分子機制還有待進(jìn)一步研究。

參·考·文·獻(xiàn)

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