夏 雨，吳姍姍，王涌善，吳俏槿，劉靄莎，黎 攀，張延杰，杜 冰

（1. 中山洪力健康食品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，廣東 中山 528437；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；3. 咀香園健康食品（中山） 有限公司，廣東 中山 528437）

0 引言

苦蕎學(xué)名為韃靼蕎麥（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn），屬蓼科（Polygonaceae） 蕎麥屬（FagopyrumMill）[1]?？嗍w能夠提供普通糧食所缺少的黃酮、槲皮素等功能性成分[2]，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的糧食作物。近年來(lái)，隨著物質(zhì)生活水平和健康意識(shí)的提高，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注苦蕎及其制品的研究開(kāi)發(fā)，苦蕎酒在降血脂、抗氧化等方面有很強(qiáng)的活性，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，值得深入研究和開(kāi)發(fā)。傳統(tǒng)苦蕎酒的釀造方法多采用固態(tài)、半固態(tài)發(fā)酵工藝，生產(chǎn)周期長(zhǎng)、原料利用率低?，F(xiàn)代苦蕎酒釀造工藝中，采用酶法液化和添加高活性干酵母，可以縮短發(fā)酵時(shí)間，提高原料的糖酒轉(zhuǎn)化率及利用率，改善酒的口感和風(fēng)味[3]。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo） 又叫黑節(jié)草，屬于微子目，為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，主要藥用部位是新鮮或干燥的莖[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛具有降血壓、抗腫瘤、降血糖等作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉主要含有多糖、黃酮、生物堿等活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗炎等藥理作用，與鐵皮石斛莖的化學(xué)構(gòu)成及藥理作用相似[6]。并且，鐵皮石斛葉對(duì)DPPH 自由基的清除能力優(yōu)于莖[7]。鐵皮石斛葉為加工鐵皮石斛鮮條的副產(chǎn)品，常被收集起來(lái)曬干廉價(jià)銷售。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)鐵皮石斛葉的開(kāi)發(fā)利用較少，市場(chǎng)上幾乎沒(méi)有以鐵皮石斛葉為主要原料的產(chǎn)品。

采用植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、產(chǎn)乳酸芽孢桿菌和釀酒酵母多種益生菌復(fù)合發(fā)酵苦蕎石斛葉2 種原料，將2 種原料的營(yíng)養(yǎng)保健功能結(jié)合起來(lái)，可以開(kāi)發(fā)出風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富的苦蕎石斛葉發(fā)酵酒，豐富發(fā)酵酒市場(chǎng)。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化苦蕎石斛葉發(fā)酵酒生產(chǎn)工藝條件，以期為苦蕎深加工提供新的方向，并為鐵皮石斛葉資源的利用提供思路，提高鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛葉，云南芒市紅河群鑫石斛種植有限公司提供；云南昭通云蕎1 號(hào)黑苦蕎，購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；芽孢桿菌（Bacillus sp.） DU-106，篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能原料評(píng)價(jià)與研究中心，菌種質(zhì)量濃度的1012CFU/g；釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） 171，安琪酵母公司提供，菌種質(zhì)量濃度108CFU/g；鼠李糖乳桿菌、產(chǎn)乳酸芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)室保留菌種，菌種質(zhì)量濃度的1012CFU/g；菊粉，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司提供；白砂糖，市售；鄰苯二甲酸氫鉀、氯化鈉、酚酞溶液、氫氧化鈉溶液，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VD-650 型桌上式潔凈式工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DHP600 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；BS110S 型精密電子天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；PHS-3D 型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的操作要點(diǎn)和工藝流程及操作要點(diǎn)

（1） 原料預(yù)處理。選取葉片完整、無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)枯萎的鐵皮石斛葉，熱燙處理10～20 s；選取籽粒飽滿、無(wú)霉變的苦蕎，研磨脫殼后淘洗加水煮熟。瀝干水分后，將石斛葉和苦蕎裝入發(fā)酵罐中；鐵皮石斛葉與苦蕎按照4∶1 的比例加入發(fā)酵罐中。

（2） 菌種活化。將0.1 g 菌粉加入50 mL 已滅菌的生理鹽水中，于30 ℃下活化30 min，得到菌種活化液。其中，菌粉是由植物乳桿菌∶鼠李糖菌∶乳酸菌DU-106∶酵母菌∶NaCl∶葡萄糖∶菊粉∶抗消化糊精按1∶1∶10∶110∶30∶300∶15∶45 配比的菌種及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成。

（3） 調(diào)配。加入一定比例的白砂糖至煮開(kāi)冷卻后的水中，攪拌使其溶解后裝入發(fā)酵罐中。

（4） 發(fā)酵。向發(fā)酵罐中添加一定量的菌種活化液，放置恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。

（5） 過(guò)濾。用0.45 μm 的濾膜過(guò)濾，得到成品。

1.3.2 苦蕎鐵皮石斛發(fā)酵酒工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

其他條件不變，分別考查發(fā)酵時(shí)間1～10 d；菌種接種量1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%；發(fā)酵溫度26，28，30，32，34 ℃；白砂糖添加量14%，16%，18%，20%，22%時(shí)對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸、酒精度的影響。

1.3.3 苦蕎石斛葉發(fā)酵酒工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定最佳的發(fā)酵工藝。

苦蕎石斛葉發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 苦蕎石斛葉發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 測(cè)定方法

酒精度[8]按GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》測(cè)定，總酸[9]按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎鐵皮石斛葉發(fā)酵酒工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響

由圖1 可知，當(dāng)發(fā)酵到第8 天時(shí)，鐵皮石斛葉發(fā)酵酒的總酸百分比達(dá)到峰值，第9 天時(shí)總酸百分比已經(jīng)開(kāi)始下降，而全過(guò)程中酒精度持續(xù)上升，但第8 天后上升趨勢(shì)減緩。

發(fā)酵前8 d，酵母菌繁殖旺盛，發(fā)酵效率較快，苦蕎石斛葉發(fā)酵酒酒精度增幅明顯；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精度增加不大，可能是酵母老化，活性程度降低，產(chǎn)酒能力下降[10]。綜合考慮酒精度和總酸含量2 個(gè)方面，確定鐵皮石斛葉發(fā)酵酒最佳發(fā)酵時(shí)間為8 d。

2.1.2 菌種接種量

菌種接種量對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 菌種接種量對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響

由圖2 可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的酒精度達(dá)到最高，之后呈下降趨勢(shì)；而總酸含量持續(xù)上升，但在接種量超過(guò)2%之后，酒精度上升趨勢(shì)下降。

在一定范圍內(nèi)，隨著菌種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物也會(huì)增加。當(dāng)菌種接種量為2%時(shí)，酒精度達(dá)到最高值，發(fā)酵較為充分。酵母需要消耗一定的糖分來(lái)維持自身的生長(zhǎng)繁殖，接種量過(guò)高時(shí)，菌種繁殖過(guò)量反而會(huì)造成底物消耗加快，代謝產(chǎn)物積累過(guò)多，限制生長(zhǎng)發(fā)酵，造成酒精轉(zhuǎn)化程度降低[11]。因此，確定最佳的菌種接種量為2%。

2.1.3 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響

由圖3 可知，在發(fā)酵溫度30 ℃時(shí)，鐵皮石斛葉發(fā)酵酒的酒精度達(dá)到峰值，而總酸含量一直持續(xù)上升。發(fā)酵溫度對(duì)酵母的生長(zhǎng)代謝和發(fā)酵速率有很大的影響。發(fā)酵溫度過(guò)低導(dǎo)致酵母生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期增長(zhǎng)；發(fā)酵溫度過(guò)高，酵母生長(zhǎng)繁殖速度過(guò)快，代謝產(chǎn)物積累增多，影響發(fā)酵酒的風(fēng)味。當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，酵母產(chǎn)酒能力達(dá)到最高值，繼續(xù)升高溫度，酒精度開(kāi)始下降[12]。因此，確定最適宜發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.1.4 白砂糖添加量

白砂糖添加量對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 白砂糖添加量對(duì)苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度的影響

由圖4 可知，在研究范圍內(nèi)，白砂糖添加量越高，對(duì)應(yīng)的鐵皮石斛葉發(fā)酵酒的總酸和酒精度就越高，當(dāng)白砂糖添加量達(dá)到18%時(shí)，總酸百分比和酒精度增長(zhǎng)相對(duì)減緩。糖度過(guò)低將導(dǎo)致酵母所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠而使最終的酒精度不足[13-14]，初始糖度為18%～22%時(shí)，酒精度升高和總酸百分比增加趨勢(shì)變緩，糖度過(guò)大，會(huì)造成發(fā)酵液滲透壓增加，抑制酵母的活性，發(fā)酵速率減慢[15]。因此，確定最適宜白砂糖添加量為18%。

2.2 苦蕎石斛葉發(fā)酵酒正交試驗(yàn)

對(duì)發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量、發(fā)酵溫度、白砂糖添加量的正交試驗(yàn)結(jié)果如下：

苦蕎石斛葉發(fā)酵酒正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 苦蕎石斛葉發(fā)酵酒正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，各因素對(duì)鐵皮石斛發(fā)酵酒酒精度的顯著影響排序是A＞D＞C＞B，各因素對(duì)鐵皮石斛發(fā)酵酒總酸含量的顯著影響排序是A＞D＞C＞B，菌種接種量對(duì)發(fā)酵酒的影響不顯著。結(jié)合成本考慮，菌種接種量選取1.5%，因此正交優(yōu)化試驗(yàn)的的最佳組合為A3B1C3D2。

3 結(jié)論

綜合酒精度和總酸百分比2 個(gè)指標(biāo)和成本，對(duì)于發(fā)酵溫度、白砂糖添加量、接種量和發(fā)酵時(shí)間的選擇分析，得出最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間9 d，接種量1.5%，發(fā)酵溫度32 ℃，白砂糖添加量18%。在此工藝條件下得到的苦蕎石斛葉發(fā)酵酒色澤均勻，酸度適宜，總酸為8.8%，酒精度為7.8%Vol。

采用苦蕎石斛葉混合發(fā)酵釀制保健酒[16]，充分利用了苦蕎和鐵皮石斛葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用， 對(duì)今后保健酒的制備有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。