楊茜 鄭憲鑫 朱亮 唐錫龍 李永紅

[摘要] 目的 探討花生四烯酸15-脂氧合酶（ALOX15）對血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）鐵死亡的影響。

方法培養(yǎng)VSMCs，分為對照組（未處理）、空載組（轉(zhuǎn)染Empty Vector）和ALOX15組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15），轉(zhuǎn)染24 h后，應(yīng)用Western blot方法檢測各組VSMCs中ALOX15蛋白表達(dá);培養(yǎng)VSMCs，分為對照組（未處理）、erastin組（加erastin）、Empty Vector+erastin組（轉(zhuǎn)染Empty Vector 12 h后加erastin）和質(zhì)粒ALOX15+erastin組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15 12 h后加erastin），應(yīng)用PI染色檢測各組細(xì)胞的死亡率。

結(jié)果 Western blot檢測結(jié)果顯示，ALOX15組ALOX15蛋白表達(dá)高于對照組、空載組，差異有顯著性（F=425.2，P<0.01）。PI染色結(jié)果表明，對照組、erastin組、Empty Vector+erastin組和質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率比較差異有顯著性，其中質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率高于其他各組（F=138.1，P<0.01）。

結(jié)論 ALOX15在VSMCs中表達(dá)， 通過過表達(dá)ALOX15可促進(jìn)erastin誘導(dǎo)的VSMCs的鐵死亡。

[關(guān)鍵詞] 肌細(xì)胞，平滑肌;肌，平滑，血管;鐵死亡;動脈粥樣硬化

[中圖分類號] R543.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0912-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.184

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211101.1334.005.html;2021-11-02 13：32：02

EFFECT OF ALOX15 ON FERROPTOSIS IN AORTIC VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS

YANG Xi， ZHENG Xianxin， ZHU Liang， TANG Xilong， LI Yonghong

（Department of Cardiology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qing-

dao 266100， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of arachidonic acid 15-lipoxygenase （ALOX15） on ferroptosis in human aortic vascular smooth muscle cells （VSMCs）.

Methods VSMCs were cultured and then divided into control group （untreated）， empty vector group （transfected with empty vector）， and ALOX15 group （transfected with plasmid ALOX15）; twenty-four hours after transfection， Western blot was used to measure ALOX15 expression in the VSMCs in each group. VSMCs were cultured and divided into control group （untreated）， erastin group （treated with erastin）， empty vector+erastin group （treated with erastin 12 h after transfection with empty vector）， and plasmid ALOX15+erastin group （treated with erastin 12 h after transfection with plasmid ALOX15）; PI staining was applied to determine the cell mortality rate in each group.

Results The results of Western blot showed that the ALOX15 protein expression was significantly higher in the ALOX15 group than in the control and empty vector groups （F=425.2，P<0.01）. The results of PI staining showed that the plasmid ALOX15+erastin group had a significantly higher cell mortality rate than the control group， erastin group， and empty vector+erastin group （F=138.1，P<0.01）.

Conclusion ALOX15 is expressed in VSMCs and can promote erastin-induced ferroptosis in VSMCs through ALOX15 overexpression.

[KEY WORDS]myocytes， smooth muscle; muscle， smooth， vascular;ferroptosis; atherosclerosis

心血管病是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。 動脈粥樣硬化被認(rèn)為是心血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的死亡參與了動脈粥樣硬化的病理生理過程[2]。鐵死亡是細(xì)胞死亡的一種形式，以細(xì)胞內(nèi)鐵依賴性和脂質(zhì)活性氧（ROS）的積累為特征[3]。多種化學(xué)和生物因素都能誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡。erastin是一種能夠選擇性殺死表達(dá)小T癌蛋白和大鼠肉瘤蛋白的工程腫瘤細(xì)胞小分子化合物，也是一種高效的鐵死亡誘導(dǎo)劑[4]?；ㄉ南┧?5-脂氧合酶 （ALOX15）是一種酶， 參與了早期的炎癥反應(yīng)[5]。研究表明，ALOX15誘導(dǎo)VSMCs在調(diào)節(jié)血管張力和血管壁重塑中發(fā)揮重要作用[6]。然而，ALOX15能否參與調(diào)控VSMC的鐵死亡途徑尚未明確。本研究旨在探討ALOX15對VSMCs鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人主動脈VSMCs購自美國ATCC公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖液、胰酶、40 g/L多聚甲醛-通用型組織固定液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;胎牛血清（FBS）購自中國吉泰依科賽公司;ALOX15過表達(dá)質(zhì)粒購自于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;erastin購自于美國Abmole公司;Lipfectamine 3000購自賽默飛世爾科技公司;RIPA裂解液（高強(qiáng)度）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、Hoechst 33342/PI雙染試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;PAGE凝膠試劑盒購于上海雅酶生物科技有限公司;ALOX15抗體購自santa cruz生物技術(shù)有限公司，β-actin抗體及羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購自affinity公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 復(fù)蘇VSMCs后，加入含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、100 mg/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO 2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)90%時傳代。

1.2.2 Western blot檢測ALOX15蛋白表達(dá)水平在6孔板中培養(yǎng)VSMCs，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時，將其分為對照組（A組，未處理）、空載組（B組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Empty Vector）、ALOX15組（C組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15），轉(zhuǎn)染24 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液并提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度。取等質(zhì)量蛋白樣品，在蛋白中加入適量的上樣緩沖液，在98 ℃金屬浴中加熱10 min。采用PAGE凝膠制備試劑盒制膠，每孔取30 μg蛋白進(jìn)行上樣。80 V恒壓電泳2.5 h，恒流（250 mA）轉(zhuǎn)膜1 h，將膜放置于質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉封閉液中搖床孵育1 h。TBST洗滌（10 min，3次），加入β-actin（1∶2 000）、ALOX15一抗（1∶2 000），4 ℃過夜孵育。TBST洗滌（10 min，3次）后加二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。TBST洗滌（10 min，3次）后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，通過Fusion Solos化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，使用Image J軟件處理圖像，分析ALOX15蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.3 PI染色檢測VSMCs死亡率 在24孔板中培養(yǎng)VSMCs，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時，分為對照組（未處理）、erastin組（加erastin）、Empty Vector+erastin組（轉(zhuǎn)染Empty Vector 12 h后加erastin）和質(zhì)粒ALOX15+erastin組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15 12 h后加erastin）。使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15及Empty Vector，根據(jù)說明書的要求操作。各組處理完后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將24孔板置于冰上，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，用細(xì)胞固定液對細(xì)胞進(jìn)行固定，30 min后棄掉細(xì)胞固定液，PBS洗3次，使用Hoechst 33342/PI雙染試劑盒檢測VSMCs死亡率，根據(jù)說明書的要求操作。最后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Tukey方法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ALOX15蛋白表達(dá)的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、空載組、ALOX15組的ALOX15蛋白表達(dá)分別為0.26±0.03、0.20±0.02和1.09±0.06，與對照組和空載組比較，ALOX15組的ALOX15蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=425.2，P<0.01）。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15明顯上調(diào)了VSMCs中ALOX15的表達(dá)。見圖1。

2.2 過表達(dá)ALOX15對細(xì)胞死亡的影響

PI染色的結(jié)果顯示，對照組、erastin組、Empty Vector+erastin組和質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率分別為（0.60±0.36）%、（9.29±0.16）%、（9.79±0.59）%和（21.41±2.42）%，各組之間比較差異有顯著意義（F=138.1，P<0.01）。其中質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率明顯高于其他3組，差異有顯著性（t=8.098～14.760，P<0.01）。

3 討論

伴隨著我國人民生活水平的明顯提高、城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速以及人口老齡化，心血管疾病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加，其中以動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)病變的腦卒中和冠心病死亡率居高不下，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了腫瘤及其他疾病。動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展過程中，VSMCs等細(xì)胞的死亡發(fā)揮著重要作用[2]。包括動脈粥樣硬化等多種疾病的病理生理過程涉及VSMCs的死亡[1]。因此，闡明VSMCs死亡的分子機(jī)制對改善血管疾病的治療有重要意義，有助于尋找新的治療靶點。盡管一些細(xì)胞死亡類型如細(xì)胞凋亡、焦亡和自噬已被闡明和VSMCs功能相關(guān)[7]，但VSMCs鐵死亡作用尚未明確。

本研究為了探討ALOX15對VSMCs鐵死亡的影響，首先構(gòu)建了erastin誘導(dǎo)VSMCs鐵死亡的細(xì)胞模型。erastin是一種鐵死亡誘導(dǎo)劑，能夠?qū)Π┘?xì)胞產(chǎn)生致命性損傷，這一功能是通過作用于線粒體電壓依賴性陰離子通道來發(fā)揮的[8]。在HT1080細(xì)胞中，erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡引發(fā)了細(xì)胞ROS的累積，而且其誘導(dǎo)的氧化性死亡是鐵依賴性的。此外，非依賴性胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)的活性也能夠被erastin所抑制[9]。將VSMCs暴露于erastin后可觸發(fā)其鐵死亡。因此，應(yīng)用erastin誘導(dǎo)VSMCs鐵死亡是一種理想VSMCs鐵死亡模型。

在多種組織和腫瘤表達(dá)的脂氧合酶（LOXs）是一種非血紅素鐵雙加氧酶。癌細(xì)胞會積聚鐵，而鐵蛋白受體介導(dǎo)的細(xì)胞外途徑和鐵蛋白吞噬所涉及的細(xì)胞內(nèi)途徑提供的鐵對于促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡至關(guān)重要[10-12]。鐵可能直接催化脂質(zhì)自由基的形成和參與脂質(zhì)過氧化的傳播，但是由LOXs催化的脂質(zhì)氧化途徑產(chǎn)生的氧化多不飽和脂肪酸可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。ALOX15為LOXs家族成員[5，14]，既往研究關(guān)注于ALOX15參與VSMCs的炎癥、增殖和遷移作用，但是ALOX15是否參與調(diào)控VSMCs中的鐵死亡尚不清楚。本研究Western blot結(jié)果顯示，與對照組組和空載組比較，ALOX15組的ALOX15蛋白表達(dá)明顯升高，這表明在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15后VSMCs中的ALOX15表達(dá)明顯升高。為了進(jìn)一步驗證ALOX15是否也參與調(diào)控VSMCs的鐵死亡，本研究應(yīng)用PI染色檢測VSMCs死亡率。結(jié)果顯示，與對照組、erastin組、Empty Vector+erastin組相比較，質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率明顯增加，表明ALOX15明顯促進(jìn)了erastin誘導(dǎo)的VSMCs死亡。推測ALOX15可能參與了erastin誘導(dǎo)下的細(xì)胞死亡。但有關(guān)鐵死亡與VSMCs關(guān)系的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步闡明。

總之，VSMCs轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15后ALOX15蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15可以促進(jìn)erastin誘導(dǎo)的VSMCs的死亡，但其作用具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]PENG R Y， JI H， JIN L B， et al. Macrophage-based therapies for atherosclerosis management[J].Journal of Immunology Research， 2020， 2020：8131754.

[2]GROOTAERT M O J， MOULIS M， ROTH L， et al. Vascular smooth muscle cell death， autophagy and senescence in atherosclerosis[J].Cardiovascular Research， 2018，114（4）：622-634.

[3]LI J， CAO F， YIN H L， et al. Ferroptosis： past， present and future[J].Cell Death & Disease， 2020，11（2）：88.

[4]ZHAO Y C， LI Y Q， ZHANG R F， et al. The role of erastin in ferroptosis and its prospects in cancer therapy[J].OncoTargets and Therapy， 2020，13：5429-5441.

[5]SINGH N K， RAO G N. Emerging role of 12/15-Lipoxyge-

nase （ALOX15） in human pathologies[J].Progress in Lipid Research， 2019，73：28-45.

[6]CHAWENGSUB Y， GAUTHIER K M， CAMPBELL W B. Role of arachidonic acid lipoxygenase metabolites in the regulation of vascular tone[J].American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology， 2009， 297（2）： H495-H507.

[7]DONG Y， CHEN H W， GAO J L， et al. Molecular machinery and interplay of apoptosis and autophagy in coronary heart di-

sease[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology， 2019，136：27-41.

[8]FANG D， MALDONADO E N. VDAC regulation： a mitochondrial target to stop cell proliferation[J].Advances in Cancer Research， 2018，138：41-69.

[9]WANG Y S， ZHAO Y， WANG H H， et al. Histone deme-

thylase KDM3B protects against ferroptosis by upregulating SLC7A11[J].FEBS Open Bio， 2020，10（4）：637-643.

[10]YANG W S， STOCKWELL B R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent， nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells[J].Che-

mistry & Biology， 2008，15（3）：234-245.

[11]GAO M H， MONIAN P， QUADRI N， et al. Glutaminolysis and transferrin regulate ferroptosis[J].Molecular Cell， 2015，59（2）：298-308.

[12]TORII S， SHINTOKU R， KUBOTA C， et al. An essential role for functional lysosomes in ferroptosis of cancer cells[J].The Biochemical Journal， 2016，473（6）：769-777.

[13]SHINTOKU R， TAKIGAWA Y， YAMADA K， et al. Lipoxygenase-mediated generation of lipid peroxides enhances ferroptosis induced by erastin and RSL3[J].Cancer Science， 2017，108（11）：2187-2194.

[14]LI Q Q， LI Q， JIA J N， et al. 12/15 lipoxygenase： a crucial enzyme in diverse types of cell death[J].Neurochemistry International， 2018，118：34-41.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）