蘇志維，盧天梅，趙美婷，李艷梅，劉玉英，高程海，劉永宏

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院， 廣西南寧 530200)

0 引言

靈菌紅素類色素是一類由微生物次級(jí)代謝所產(chǎn)生的，具有3個(gè)吡咯環(huán)母核結(jié)構(gòu)的天然紅色素的總稱[1]，根據(jù)其側(cè)鏈烷基的長(zhǎng)短及環(huán)化位置不同可分為多種結(jié)構(gòu)類似物，包括靈菌紅素、庚基靈菌紅素、十一烷基靈菌紅素、環(huán)烷基靈菌紅素、間環(huán)丙菌素、鏈玉紅菌素B等[2]。靈菌紅素是三吡咯類微生物色素的典型代表，研究人員已分離到很多產(chǎn)靈菌紅素類物質(zhì)的微生物，其中沙雷氏菌[3]、假單胞菌[4]、河氏菌[5]、弧菌[6]等是主產(chǎn)靈菌紅素的菌屬。庚基靈菌紅素是靈菌紅素的結(jié)構(gòu)類似物，其區(qū)別僅在于吡咯C環(huán)的3-位烷基側(cè)鏈被庚基取代。目前，僅有為數(shù)不多的菌株如Pseudovibriodenitrificans[7]、P.magnesiorubra[8]和Vibriogazogenes[9]被報(bào)道可產(chǎn)庚基靈菌紅素，且產(chǎn)量極低，如主產(chǎn)靈菌紅素的細(xì)菌P.magnesiorubra，其產(chǎn)生的庚基靈菌紅素的比例僅占總代謝物的1%[7]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素及其類似物具有廣泛的生物活性，在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理、紡織染料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值[1,2,10-13]。

目前針對(duì)產(chǎn)靈菌紅素菌種誘變改良的方法較多，包括利用紫外或微波技術(shù)處理的物理誘變法[4,14]、用EMS處理的化學(xué)誘變法[5]和復(fù)合誘變法[15]等。張德偉等[16]采用常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)誘變篩選靈菌紅素生產(chǎn)菌突變株，使靈菌紅素產(chǎn)量比誘變前提高1.23倍。與其他誘變育種手段相比，利用ARTP進(jìn)行微生物誘變育種可造成DNA多樣性損傷，且具有操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)有毒有害物質(zhì)參與誘變過(guò)程、突變率高等優(yōu)點(diǎn)，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株[17]。目前尚未有關(guān)于使用ARTP誘變篩選庚基靈菌紅素高產(chǎn)菌株的方法報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)一株非致病性的海洋細(xì)菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072(簡(jiǎn)稱C9)，其主要代謝產(chǎn)物為庚基靈菌紅素，對(duì)高溫、紫外線照射具有較強(qiáng)的抗性[18]。為了使海洋細(xì)菌C9能更高效、大量合成庚基靈菌紅素，本研究以C9為出發(fā)菌株，利用ARTP進(jìn)行誘變，并結(jié)合遺傳穩(wěn)定性測(cè)試，篩選穩(wěn)定高產(chǎn)庚基靈菌紅素的菌株，為庚基靈菌紅素的生產(chǎn)發(fā)酵、現(xiàn)代藥理研究提供理論依據(jù)和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

酵母粉、麥芽提取粉、葡萄糖和瓊脂(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)，海鹽(廣東鹽業(yè)集團(tuán)有限公司)，甲醇、丙酮和鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 菌種

海洋細(xì)菌C9來(lái)源于廣西防城港怪石灘的海綿，經(jīng)16S RNA測(cè)序鑒定為Notoacmeibacter屬的一個(gè)種，本實(shí)驗(yàn)室選育保藏，編號(hào)為BGMRC2072。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良ISP2液體培養(yǎng)基(1 L)：酵母粉0.2%，麥芽提取粉0.2%，葡萄糖0.2%，海鹽3%，加水溶解后121℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加1.3%瓊脂。

1.1.4 主要儀器

高壓滅菌鍋(日本PHCbi，型號(hào)：MLS-371L-PC)，萬(wàn)分之一電子分析天平(廣州梅特勒，型號(hào)：ML204T)，DHG-9246A電熱鼓風(fēng)干燥箱和SHP-250生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精科電子有限公司，型號(hào)：721G)，常溫等離子誘變育種儀(無(wú)錫源清天木有限公司，型號(hào)：APTR-lls)，臺(tái)式高速離心機(jī)(立日本日)，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：SW-CJ-2F)，純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號(hào)：UPH-ll-JDZB)，手動(dòng)移液槍(艾本德國(guó)際貿(mào)易有限公司，型號(hào)：Eppendorf-100/1000型)，恒溫振蕩器(蘇州精騏有限公司，型號(hào)：IS-RDS3)。

1.2 方法

1.2.1 菌體干重及比生長(zhǎng)速率測(cè)定

結(jié)合Tu等[19]和Cao等[20]的方法，利用分光光度法測(cè)定600 nm處的光密度值(OD600)及菌體干重(CDW)來(lái)衡量菌體的生長(zhǎng)情況。收集待測(cè)菌液加入離心管中，10 000 r/min 快速離心5 min收集菌體，棄上清，菌體用蒸餾水清洗3遍，100℃干燥至恒重。

菌體的比生長(zhǎng)速率μ=(lnWt-lnW0)/T，

其中，W0和Wt分別代表進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體OD600初始值和最終值，T代表培養(yǎng)時(shí)間(h)。

1.2.2 ARTP誘變處理方法

(1)ARTP誘變致死曲線

將菌種從-80℃超低溫冰箱中取出，轉(zhuǎn)接至改良ISP2固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2—3 d后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至改良ISP2液體培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min培養(yǎng)30—40 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集菌液，10 000 r/min 快速離心5 min，棄上清，用5%甘油生理鹽水重懸，分光光度計(jì)測(cè)量菌懸液OD600為0.6—0.8。取10 μL菌懸液至ARTP誘變金屬載片上進(jìn)行誘變，以99.99% 氦氣作為工作氣體(流量10 mL/min)，在電源功率115 W的條件下分別誘變處理0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，105 s。誘變結(jié)束后用5%甘油生理鹽水稀釋，分別取10-4、10-5和10-63個(gè)濃度的菌液100 μL涂布于改良ISP2固體培養(yǎng)基平板上，置于28℃培養(yǎng)2—3 d后記錄每皿菌落數(shù)，計(jì)算誘變致死率，繪制致死率曲線。

(2)誘變時(shí)間確定

結(jié)合張德偉等[16]和Cao等[20]的方法，綜合考慮不同生長(zhǎng)階段的正負(fù)突變率及比生長(zhǎng)速率，確定最佳誘變時(shí)間。若突變菌株的考察指標(biāo)值(菌落形態(tài)、顏色、OD600、比生長(zhǎng)速率等)高于原始菌株視為正突變，反之則視為負(fù)突變。

1.2.3 突變菌株的篩選

在最佳處理時(shí)間下誘變后，根據(jù)平板上菌落的生長(zhǎng)狀況挑取生長(zhǎng)大而豐滿、色澤鮮艷、菌落直徑較大的單菌落，接種于裝有50 mL 改良ISP2液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min 培養(yǎng)34 h。利用分光光度法測(cè)定菌體的OD600并觀察菌體顏色、形態(tài)進(jìn)行初篩，再通過(guò)測(cè)定初篩突變菌株的庚基靈菌紅素含量進(jìn)行復(fù)篩，最后將復(fù)篩得到的突變菌株接種發(fā)酵，以菌體生物量為指標(biāo)篩選優(yōu)勢(shì)突變菌株。

1.2.4 庚基靈菌紅素的提取與檢測(cè)

取1 mL培養(yǎng)至34 h的菌體發(fā)酵液，加入9 mL酸性甲醇(pH=3)，震蕩破壁，10 000 r/min 快速離心5 min，至菌體基本無(wú)色，取上清液稀釋至合適濃度后，用分光光度計(jì)檢測(cè)536 nm處的吸光值。庚基靈菌紅素含量的計(jì)算公式為

庚基靈菌紅素含量(μg/mL)=(19.076×

OD536+0.800)×D×V，

其中，D為色素浸提液的稀釋倍數(shù)，V為發(fā)酵液的體積(mL)。

1.2.5 突變菌株的穩(wěn)定性

將復(fù)篩得的突變菌株接種于改良ISP2固體培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)10代，再分別轉(zhuǎn)接到改良ISP2液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，并測(cè)定10代菌種的庚基靈菌紅素產(chǎn)量，考察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死曲線

如圖1所示，致死率隨著誘變時(shí)間的增加而增大，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到40 s后，ARTP誘變導(dǎo)致的菌株致死率上升緩慢；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到50 s后，菌株的致死率達(dá)90%以上且趨于平緩；誘變時(shí)間大于60 s后致死率小幅度回落?，F(xiàn)代育種研究表明，致死率達(dá)到90%以上時(shí)，菌株正突變概率大大增加[21]。但由于在只知致死率大小的情況下，無(wú)法判斷50，60，70 s中哪個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)造成正突變的概率最大，因此還需結(jié)合這3個(gè)時(shí)間段的正負(fù)突變率來(lái)綜合考慮最終選擇的誘變處理時(shí)間。

2.2 最佳突變時(shí)間

選擇菌體生長(zhǎng)初始期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期3個(gè)階段綜合考察菌體突變情況，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)處理50 s時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正突變率最高，但初始期的正突變率較低；當(dāng)處理70 s時(shí)，初始期的正突變率最高，但對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正突變率最低；只有處理時(shí)間為60 s時(shí)，初始期、穩(wěn)定期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正負(fù)突變率都較均衡。經(jīng)綜合考慮，最終選擇60 s作為突變處理時(shí)間。

圖1 ARTP誘變致死率曲線

圖2 不同處理時(shí)間的正負(fù)突變率

2.3 突變菌株篩選

A、B兩組出發(fā)菌株經(jīng)ARTP平行誘變處理60 s后，根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況挑取生長(zhǎng)大而豐滿，色澤鮮艷的菌落，接種發(fā)酵后測(cè)定菌液OD600，并觀察菌體顏色深淺，初篩得到35株OD600高于出發(fā)菌株且發(fā)酵顏色較深的突變株，測(cè)定其庚基靈菌紅素含量進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)文獻(xiàn)[20]，選擇與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量增加20%以上的菌株作為正突變篩選范圍，可以看出庚基靈菌紅素產(chǎn)量超過(guò)20%的菌株有A6、A7、A10、A11、A13、B4、B5、B6、B10、B13共10株。

將上述篩選的10株突變菌株接種發(fā)酵，以生物量為指標(biāo)篩選優(yōu)勢(shì)突變菌株，如圖4a所示，大多數(shù)突變菌株在穩(wěn)定期OD600與比生長(zhǎng)速率無(wú)較大差別，而A11和B10這兩株突變菌株在穩(wěn)定期OD600和比生長(zhǎng)速率明顯低于其他平行突變菌株，生長(zhǎng)穩(wěn)定性欠佳。結(jié)合突變菌株菌體生物量(圖4b)，除了突變菌株A10的菌體生物量顯著性高于出發(fā)菌株及其他突變菌株外，其余的菌株菌體生物量無(wú)較大差別，其中B5、B13這2株突變菌株略高于出發(fā)菌株。綜合菌落形態(tài)、庚基靈菌紅素產(chǎn)量和菌體生物量等因素，最終選擇B5、B13這2株突變菌株進(jìn)行下一輪的遺傳穩(wěn)定性復(fù)篩。

圖3 突變菌株的庚基靈菌紅素產(chǎn)量

**表示突變菌株A10菌體生物量顯著高于其他水平突變株

2.4 突變菌株的穩(wěn)定性

突變菌株B5在傳代3代后菌株的庚基靈菌紅素產(chǎn)量開(kāi)始下降(圖5a)，推測(cè)突變菌株B5的遺傳不穩(wěn)定；而突變菌株B13的庚基靈菌紅素產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定在748.91—756.27 μg/mL，沒(méi)有隨著傳代數(shù)的增加而下降(圖5b)，所以最終確定突變菌株B13為最佳突變菌株。

圖5 B5和B13的遺傳穩(wěn)定性

3 討論

海洋細(xì)菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072代謝過(guò)程中主要累積庚基靈菌紅素，盡管生物合成途徑未明確，但課題組前期研究發(fā)現(xiàn)庚基靈菌紅素在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前期產(chǎn)量極低，培養(yǎng)16—32 h菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后開(kāi)始大量合成，并于接種后40 h達(dá)到最大值，約為(384.27±13.25) mg/L，且這類靈菌紅素對(duì)高溫、紫外線照射具有較強(qiáng)的抗性[18]，因此提高海洋細(xì)菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072的庚基靈菌紅素生產(chǎn)能力具有重要的研究意義。利用ARTP誘變技術(shù)得到的突變菌株存在正突變和負(fù)突變，為了快速高效地篩選到有利的菌株，結(jié)合菌株生長(zhǎng)形態(tài)和生物量(OD600)進(jìn)行快速初篩。金瑋玥等[22]通過(guò)測(cè)定OD600并觀察菌株顏色深淺進(jìn)行初篩，最終結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選到一株高產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株。Cao等[20]綜合考慮菌體密度、比生長(zhǎng)速率、菌體干重、脂肪酸產(chǎn)率等最終獲得一株總脂肪酸含量明顯提高的突變株，該方法顯著提高ARTP誘變突變株的篩選效率。本研究通過(guò)觀察單菌落的形態(tài)及顏色，結(jié)合細(xì)菌生物量OD600進(jìn)行初篩，得到35株突變株，再通過(guò)測(cè)定初篩菌株的庚基靈菌紅素的產(chǎn)量，獲得10株庚基靈菌紅素產(chǎn)量高于出發(fā)菌株產(chǎn)量20%的突變株，最后以生物量為指標(biāo)篩選優(yōu)勢(shì)突變菌。結(jié)果表明突變菌株的菌體生物量和庚基靈菌紅素產(chǎn)量均高于出發(fā)菌株，進(jìn)一步證明通過(guò)菌體生物量、單菌落個(gè)體大小及菌體顏色深淺能夠提示菌株發(fā)生了正突變。

為了更好地發(fā)酵生產(chǎn)庚基靈菌紅素，下一步還需對(duì)突變菌株開(kāi)展培養(yǎng)條件優(yōu)化、發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)等，并對(duì)突變菌株進(jìn)行全基因測(cè)序分析，明確庚基靈菌紅素的生物合成分子調(diào)控機(jī)理，為實(shí)現(xiàn)庚基靈菌紅素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以海洋細(xì)菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072為出發(fā)菌株，利用常壓室溫等離子體(ARTP)進(jìn)行誘變，得到一株高產(chǎn)庚基靈菌紅素的突變菌株B13，其庚基靈菌紅素產(chǎn)量為748.91 μg/mL，而出發(fā)菌株為384.27 μg/mL，突變菌株B13比原始菌株的庚基靈菌紅素產(chǎn)量增加了94.9%，且突變菌株B13具有良好的遺傳穩(wěn)定性。