劉曉柱，趙湖冰，黎華，李銀鳳，于志海，劉曉輝，HARDIE William James，2，黃名正*

（1.貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2.常州大學(xué)，江蘇 常州 213000）

釀造酒由原料經(jīng)發(fā)酵后獲得的酒精飲料，原料轉(zhuǎn)化為乙醇主要由酵母菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。根據(jù)酵母菌發(fā)酵特性將其分成釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非釀酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae，NSc）兩大類[1]。Sc主要進(jìn)行酒精發(fā)酵，將原料中的糖轉(zhuǎn)化為乙醇、二氧化碳和其它副產(chǎn)物[2]。利用Sc進(jìn)行純種發(fā)酵，操作簡單、易于控制，但發(fā)酵酒中風(fēng)味物質(zhì)種類及含量均有限，酒質(zhì)風(fēng)味較為單一。近年來利用NSc與Sc進(jìn)行混合發(fā)酵改善果酒的風(fēng)味，已成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)。NSc可產(chǎn)生多種酯類、醇類、甘油以及多種酸類等風(fēng)味物質(zhì)，在很大程度上影響果酒的色澤、風(fēng)味以及復(fù)雜度，對(duì)果酒的感官品評(píng)具有重要的影響[3-5]。

美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，Mp）是一種常見的NSc，天然存在于各種水果、蜜腺、花朵等植物結(jié)構(gòu)上[6]。在葡萄汁的酒精發(fā)酵前期，通常情況下可以檢測到Mp的存在。Clemente-Jimenez等研究發(fā)現(xiàn)，在Mp與Sc共培養(yǎng)時(shí)，二者具有協(xié)同作用，有助于包括脂肪酸、酯和萜烯醇等多種芳香化合物的產(chǎn)生[7]。研究還發(fā)現(xiàn)，某些Mp菌株能夠表達(dá)高水平的β-葡萄糖苷酶，并作用于多種含糖苷鍵的風(fēng)味前體物質(zhì)，有助于如萜烯類風(fēng)味物質(zhì)的釋放，增強(qiáng)酒體風(fēng)味特性[8]。此外，Mp與Sc混合發(fā)酵還能夠降低發(fā)酵酒中的乙醇含量，同時(shí)增加酒體復(fù)雜度，可用于低度酒的發(fā)酵生產(chǎn)[9]。但Mp與Sc混合發(fā)酵對(duì)火龍果酒特性的影響還未見有相關(guān)報(bào)道。

火龍果是一種廣泛分布于我國南方地區(qū)的水果品種，包括紅皮白肉、紅皮紅肉和黃皮白肉3種，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)[10]。貴州省2001年開始引種試種，作為全省農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命重點(diǎn)發(fā)展的水果之一，截至2018年，全省火龍果總產(chǎn)量為4.6萬噸，產(chǎn)值達(dá)4.1億元。羅甸火龍果和關(guān)嶺火龍果也已成為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，受到國家層次的保護(hù)。由火龍果發(fā)酵生產(chǎn)的火龍果酒，香氣獨(dú)特，口感較佳，且兼具保健功能，深受消費(fèi)者的喜愛[11]。但目前火龍果酒發(fā)酵菌株通常采用葡萄酒活性干酵母，菌株品種有限，發(fā)酵酒體單一，同質(zhì)化較為嚴(yán)重。采用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，可較好的解決這一問題。因此，本研究采用非釀酒酵母Mp與Sc共接種，進(jìn)行混合發(fā)酵，分析其對(duì)火龍果酒品質(zhì)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅心火龍果：貴州省安順市關(guān)嶺縣；賴氨酸固體培養(yǎng)基、WL營養(yǎng)瓊脂鑒定培養(yǎng)基（Wallerstein laboratory nutrient agar）：貴州博奧瑞杰生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；Mp：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；Sc ZYMAFLORE X16（簡稱X16）：法國LAFFORT公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UH5300紫外分光光度計(jì)：日本日立公司；雷磁PHSJ-3F pH儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SA408B電子舌味覺系統(tǒng)：日本Insent公司；TQ8040NX氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone eextrose medium，YEPD）（酵母浸粉 10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L）活化-80℃保存的Mp、Sc菌株。挑取Mp、Sc單克隆分別接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.2 發(fā)酵條件

取新鮮火龍果，去皮，打漿，調(diào)整糖度為24°Brix，pH值為3.5，加入40 mg/L二氧化硫、200 mg/L果膠酶，過夜處理。分裝處理后的火龍果漿至2 L無菌三角瓶中，裝量為70%。將培養(yǎng)好的Mp、Sc接種至火龍果漿中，使其Mp終濃度為107cfu/mL，Sc終濃度為106cfu/mL。接種方式為Mp+Sc組共同接種Mp和Sc菌株，Sc組單獨(dú)接種Sc菌株。接種后，插上呼吸器，密封，室溫（24℃）放置12 h。待發(fā)酵啟動(dòng)后，轉(zhuǎn)移至18℃冷庫中，靜置發(fā)酵 16 d。分別在發(fā)酵的第 0、2、4、8、12、16 天取樣，（1）稱重，計(jì)算 CO2釋放率；（2）測定 pH 值；（3）經(jīng)適當(dāng)濃度梯度稀釋后，分別涂布在賴氨酸培養(yǎng)基和上，培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)，從而分析Mp、Sc菌株細(xì)胞個(gè)數(shù)。發(fā)酵結(jié)束后，離心，取上清液，分別用于常規(guī)理化指標(biāo)、電子舌和氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas phase mass spectrometer，GC-MS）檢測。

1.3.3 測定條件

1.3.3.1 火龍果酒常規(guī)理化指標(biāo)測定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定火龍果酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值、總酸、總糖。

1.3.3.2 火龍果酒感官特性測定

取80 mL火龍果酒樣品至電子舌檢測燒杯中。按照儀器說明書步驟，進(jìn)行火龍果酒感官特性的檢測。采樣時(shí)間120 s，采樣速度為1次/s，每個(gè)樣品平行測定3次。

1.3.3.3 火龍果酒揮發(fā)性香氣特性測定

采用頂空固相微萃?。╯olidphase microextraction，SPME）技術(shù)提取火龍果酒香氣成分，參考李凱等方法對(duì)火龍果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)行分析[11]。以環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行物質(zhì)的定量分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果特性

釀造原料紅心火龍果采摘于2018年9月貴州省安順市關(guān)嶺縣，顏色粉紅色，糖度為（9.1±0.01）°Brix，pH 值為 3.41±0.01（圖 1）。

圖1 本研究所用紅心火龍果Fig.1 Red pitaya used in this study

2.2 菌株生長特性

Mp和Sc以共接種的形式進(jìn)行混合發(fā)酵火龍果酒，各菌群變化趨勢如圖2所示。

在發(fā)酵前4 d，非釀酒酵母Mp在總的酵母菌群中占較大的百分比，但其比例在不斷降低，在發(fā)酵第8天基本上檢測不到Mp菌群，發(fā)酵液中主要為Sc，一直維持到發(fā)酵結(jié)束。而釀酒酵母Sc隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，其菌群數(shù)量在不斷增多，在發(fā)酵的第4天，在發(fā)酵液中所占比例超過Mp，并繼續(xù)增加，在發(fā)酵第8天基本上很難檢測到Mp菌群。

圖2 共接種發(fā)酵火龍果酒酵母菌群動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of yeast population in pitaya wine fermentation with co-inoculation

2.3 pH值、CO2釋放率動(dòng)態(tài)變化

龍果酒發(fā)酵過程中pH值和CO2釋放率動(dòng)態(tài)變化見圖3。

圖3 火龍果酒發(fā)酵過程中pH值和CO2釋放率動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of pH and CO2emission rate using Sc or Mp+Sc

在火龍果酒發(fā)酵過程中，CO2釋放率逐漸增大，且混菌發(fā)酵組（Mp+Sc）CO2釋放率要高于Sc組，在發(fā)酵的第4天達(dá)到最大值。接著逐漸降低，在第8、12、16天，兩組CO2釋放率基本一致（圖3A）。

隨著火龍果酒的發(fā)酵，發(fā)酵液pH值在發(fā)酵前期（前 4 d）逐漸降低，發(fā)酵中后期（4 d～16 d）又增加，表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。但變化幅度不大。發(fā)酵初始pH值為5.0，在第4天，Sc發(fā)酵液pH值為3.3，Mp+Sc發(fā)酵液pH值為3.4。發(fā)酵結(jié)束的第16天，兩組發(fā)酵液pH值均又增大到3.5（圖3B）。

2.4 混合發(fā)酵火龍果酒基本理化指標(biāo)

Mp與Sc混合發(fā)酵火龍果酒基本理化指標(biāo)如表1所示。

表1 火龍果酒理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indicators of pitaya wine

與商業(yè)化釀酒酵母Sc組相比，混合發(fā)酵火龍果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值、總糖3個(gè)指標(biāo)與Sc組發(fā)酵火龍果酒沒有區(qū)別。但混合發(fā)酵火龍果酒揮發(fā)酸顯著低于純種Sc發(fā)酵火龍果酒。

2.5 混合發(fā)酵火龍果酒感官特性

采用電子舌傳感器，從酸味、苦味、澀味、后味、鮮味、咸味等方面分析Mp與Sc混合發(fā)酵對(duì)火龍果感官特性的影響?；瘕埞谱涛秾傩岳走_(dá)圖見圖4。

圖4 火龍果酒滋味屬性雷達(dá)圖Fig.4 Pitaya wine taste attribute radar chart

結(jié)果如圖4所示，混合發(fā)酵火龍果酒酸味測定值顯著小于Sc純種發(fā)酵火龍果酒（P<0.05）。其它感官數(shù)值Mp+Sc組與Sc組之間無顯著區(qū)別。

2.6 混合發(fā)酵火龍果酒香氣特性

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法分析Mp與Sc混合發(fā)酵對(duì)火龍果香氣特性的影響。火龍果酒中揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量見表2。

結(jié)果如表2所示，Mp+Sc混合發(fā)酵火龍果酒中共檢測出46種揮發(fā)性物質(zhì)成份，包括酸類物質(zhì)3種、醇類物質(zhì)16種、酯類物質(zhì)18種、醛酮類物質(zhì)3種、烴類物質(zhì)2種、其它類物質(zhì)4種；Sc純種發(fā)酵火龍果酒中僅檢測到39種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酸類物質(zhì)3種、醇類物質(zhì)13種、酯類物質(zhì)16種、醛酮類物質(zhì)2種、烴類物質(zhì)2種、其它類物質(zhì)3種。其中在醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、醛酮類物質(zhì)、其它類物質(zhì)方面Mp+Sc混合發(fā)酵均增加了物質(zhì)的種類。

表2 火龍果酒中揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量Table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine

續(xù)表2 火龍果酒中揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量Continue table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine

盡管Mp+Sc混合發(fā)酵火龍果酒中酸類物質(zhì)和烴類物質(zhì)的種類均比Sc組增加，但這些類物質(zhì)總量卻未增加。Mp+Sc組、Sc組酸類物質(zhì)總量分別為（2.84±0.14）、（2.42±0.23）mg/L，烴類物質(zhì)總量分別為（0.51±0.04）、（0.34±0.03）mg/L。另外，Mp+Sc混合發(fā)酵火龍果酒中既增加了酯類物質(zhì)、醛酮類物質(zhì)、其它類物質(zhì)的種類和含量。

醇類是酒類中含量較高的一類化合物，主要呈現(xiàn)出清香和清鮮香氣?；旌习l(fā)酵增加了醇類物質(zhì)種類，Mp+Sc發(fā)酵火龍果酒中檢測到16種醇類物質(zhì)，比Sc單獨(dú)發(fā)酵多3種。但混合發(fā)酵并未增加醇類物質(zhì)總量，相反醇類物質(zhì)總量低于Sc純種發(fā)酵火龍果酒，兩種發(fā)酵火龍果酒中醇類物質(zhì)總量分別為（27.61±1.31）mg/L和（30.46±1.72）mg/L（圖 5）。

圖5 火龍果酒中揮發(fā)性物質(zhì)含量Fig.5 Contents of aroma substances in pitaya wine

高級(jí)醇，又稱雜醇油，是碳原子數(shù)大于2的脂肪族醇類的統(tǒng)稱。分析發(fā)現(xiàn)，Mp+Sc混合發(fā)酵火龍果酒中高級(jí)醇的含量也較Sc發(fā)酵火龍果酒中低。

酯類物質(zhì)是各種酒中主要呈香物質(zhì)之一，閾值一般較低，常具有各種花香和水果香。在2種火龍果發(fā)酵果酒中主要的酯類物質(zhì)均為辛酸乙酯、己酸乙酯和葵酸乙酯，在Mp+Sc混合發(fā)酵火龍果酒中其占酯類物質(zhì)比例分別為49.36%、20.02%、19.35%，在Sc純種發(fā)酵火龍果酒中其占酯類物質(zhì)比例分別為51.40%、23.09%、16.59%。辛酸異戊酯、δ-己醇內(nèi)酯和N-甲氧羰基-L-脯氨酸十八烷基酯是Mp+Sc混合發(fā)酵火龍果酒中特有酯類物質(zhì)；3-甲基-2-丁烯-1-基-丁酸酯是Sc純種發(fā)酵火龍果酒中特有酯類物質(zhì)?；旌习l(fā)酵火龍果酒中酯類物質(zhì)總量高于Sc純種發(fā)酵火龍果酒中含量。

風(fēng)味活性值（odour activity value，OAV）為香氣物質(zhì)濃度與該物質(zhì)閾值的比值，用來評(píng)價(jià)食品中香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)度。一般OAV>1，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)香氣成分有著突出的貢獻(xiàn)度。反之，OAV<1，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)香氣成分貢獻(xiàn)度不大。分析了2種發(fā)酵火龍果酒中19種主要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)OAV值，見表4。

表4 火龍果酒中主要香氣物質(zhì)OAVTable 4 The OAV of main aroma substances in pitaya wine

發(fā)現(xiàn)OAV>1的物質(zhì)有13種，OAV<1的有6種。在Mp+Sc混合發(fā)酵火龍果酒中OAV>1的有12種，OAV值最大的是辛酸乙酯，為4 080.81，OAV<1有7種，OAV值最小的為丁二酸二乙酯，為0.01。

3 討論與結(jié)論

由于NSc最初是在變質(zhì)的葡萄酒中分離出來的，因此，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其為葡萄酒釀造中的腐敗菌群，一直未受到重視。但越來越多的研究表明，NSc在葡萄酒、多種果酒的酒體形成過程中發(fā)揮積極作用，有助于增加酒體的豐富性和感官特性[12]。因此，近年來對(duì)NSc生物多樣性、釀酒特性及相關(guān)應(yīng)用研究成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。其研究領(lǐng)域也由葡萄酒領(lǐng)域拓展到多種果酒領(lǐng)域，如刺梨果酒[13]、野櫻莓果酒[14]、柿子果酒[15]、蜜桔果酒[16]等。但NSc對(duì)火龍果酒品質(zhì)的影響還未知。本研究以Mp與Sc共接種的方式進(jìn)行了火龍果酒的發(fā)酵，以Sc純種發(fā)酵為對(duì)照，結(jié)果表明，Mp與Sc混合發(fā)酵降低了火龍果酒中揮發(fā)酸的含量，增加了揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量，如酯類、醛酮類、烴類等，使得酒體豐富度更加復(fù)雜。

研究表明，Mp中的某些菌株可分泌多種酶類，如果膠酶、蛋白酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、亞硫酸鹽還原酶、木聚糖酶、脂肪酶等，其中一些酶作用于相關(guān)底物，有助于風(fēng)味物質(zhì)的釋放[6，17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，采用Mp與Sc混合發(fā)酵增加了多種酯類物質(zhì)的種類和含量，以及多種醇類物質(zhì)的種類。這可能與Mp分泌的一些酶類相關(guān)，因此，在后續(xù)的研究中，將深入分析所用Mp菌株酶學(xué)特性，剖析揮發(fā)性香氣物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)理。

本研究還進(jìn)一步分析了混合發(fā)酵過程中Mp菌群動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，Mp在發(fā)酵菌群中所占比例逐漸降低，在發(fā)酵第4天所占比例低于50%，在發(fā)酵的第8天開始，發(fā)酵液中很難檢測到Mp菌群了。通常情況下，Mp對(duì)酒精較為敏感，對(duì)酒精的耐受性較差，隨著酒精發(fā)酵的不斷進(jìn)行，逐漸死亡，故Mp主要在酒精發(fā)酵的前期發(fā)揮作用，產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì)，豐富酒體。因此，研究報(bào)道，采用Mp與Sc混合發(fā)酵有助于降低發(fā)酵酒的乙醇含量，可用于低度果酒的生產(chǎn)[19]。但本研究中，混合發(fā)酵火龍果酒乙醇含量與Sc純種發(fā)酵火龍果酒相比，未見有顯著區(qū)別，可能與菌株本身特性，或者接種方式有關(guān)。

此外，Mp還可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)普切明（pulcherrimin），通過競爭性吸收環(huán)境中的鐵離子，抑制其它微生物對(duì)鐵離子的需求，可作為一種光譜性抗菌劑[20-22]。因此，在果酒生產(chǎn)中，采用Mp作為生產(chǎn)菌種，通過生物防控，可有效抑制野生雜菌，減少二氧化硫的使用量。

綜上，本研究首次分析了Mp與Sc混合發(fā)酵對(duì)火龍果酒特性的影響。結(jié)果表明，Mp與Sc混合發(fā)酵可有效降低火龍果酒中揮發(fā)酸含量，增加酒體中酯類、醇類、醛酮類、烴類等揮發(fā)性物質(zhì)的種類，降低了酸類、醇類物質(zhì)的含量。此外，Mp與Sc混合發(fā)酵還降低了酸味感官特性。因此，Mp與Sc混合發(fā)酵是一種可以推薦的火龍果酒的生產(chǎn)方式，既增加了酒體的復(fù)雜度，又降低了同質(zhì)化現(xiàn)象。但本研究僅分析了Mp與Sc混合發(fā)酵的一種接種方式，一種接種比例，更多的發(fā)酵方式還需要分析比較，從而確定較優(yōu)的生產(chǎn)方式。