劉垚杰，劉瑩，劉東，韓英，馮祥茹，王浩

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

枸杞子（Fructus lycii）是枸杞果實的干制品，具有很高的食用價值，有著悠久的應(yīng)用史[1]。枸杞子具有抗氧化、預(yù)防視網(wǎng)膜損傷、抗細胞凋亡等作用[2-4]。就我國枸杞的種植情況上看，比較知名的有寧夏枸杞、新疆枸杞等，其中包括3個變異品種[5]。近年來，對枸杞大部分的研究發(fā)現(xiàn)，碳水化合物占枸杞子總重的45% ～50%，其中包括豐富的枸杞多糖，枸杞多糖的得率大部分在1% ～4%之間。蛋白質(zhì)占枸杞子總重的10% ～15%[6]。除此以外，枸杞子中還包括一些黃酮類、生物堿和維生素類物質(zhì)，占比不超過枸杞子總重的0.02%。經(jīng)了解，枸杞多糖屬于細胞內(nèi)源性物質(zhì)，該糖是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖組成，具有很高的潛在利用價值[7]。

Song等[8]研究顯示持續(xù)的光照會引起視網(wǎng)膜組織的損傷，其機制可能是因為長時間光照過程促使視網(wǎng)膜產(chǎn)生過量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），從而引起視網(wǎng)膜功能受損。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞是一種光感受器細胞，雖然本身具有一定的抗氧化能力[9-11]，但長時間在強光環(huán)境下工作，自由基含量上升，會引起RPE層細胞功能受損。這種損害使得黃斑區(qū)光感受器細胞功能下降，伴有視力受損，同時造成脈絡(luò)膜新生血管的生成。

為了探究枸杞子對小鼠視網(wǎng)膜的保護作用，擬采用枸杞多糖粗提物為原料，以光損傷小鼠為模型，通過視網(wǎng)膜電圖和光學(xué)相干斷層成像等相關(guān)視網(wǎng)膜生理指標(biāo)檢測，探討枸杞子對光損傷小鼠視網(wǎng)膜的影響，以期為枸杞子視力保護產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

基礎(chǔ)飼料：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒、喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙醛（AR>99%）：上海麥克林生化科技有限公司；復(fù)方托吡卡胺滴眼液：參天制藥（中國）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈陽興齊眼藥股份有限公司。

FA2004型分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；EPIC-4000視網(wǎng)膜電圖（ERG）儀：美國LKC科技有限公司；MicronⅣ光學(xué)相干斷層掃描（OCT）儀器：美國Phoenix研究實驗室；LS C300dⅡ型LED燈：深圳市愛圖仕影像器材有限公司；U-3900Hitachi紫外分光光度計：日立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 枸杞多糖粗提物制備

稱取枸杞子（符合2015版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)）藥材，每次提取水量為藥材體積6倍，提取3次，合并提取液，提取液經(jīng)濃縮得到水提物浸膏，再經(jīng)醇沉（含乙醇量為80%）、干燥，制得枸杞多糖粗提物（每克枸杞多糖粗提物含枸杞子生藥3.488 g）。參考蔡紅梅等[10]的粗多糖檢測方法（苯酚硫酸法）檢測得到枸杞子中粗多糖含量為2.77%。

1.3 實驗動物

健康雄性 C57BL/6J小鼠，6 周齡，（18±1）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[許可證號為SCXK（京）2016-0002]，飼養(yǎng)于天津科技大學(xué)實驗動物中心[（23±2）℃，相對濕度55%，明暗循環(huán)為12 h/12 h]，攝食和飲水自由。本研究的所有實驗程序均按照天津科技大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)的方案進行。

1.4 光損傷模型制備及動物分組

動物適應(yīng)1周后，實驗分組，每組12只，采用灌胃方式分別對5組實驗動物給藥，其中正常組（NOR）和光損傷模型組（MOD）每天每只灌胃無菌生理鹽水0.2 mL；根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，枸杞子低（GQL）、中（GQM）和高劑量組（GQH）的給藥劑量分別為每天280、370、460 mg/kg bw，連續(xù)給藥8周。實驗組小鼠在第9周進行強光照射，光強為（9 000±500）Lux，每天照射 4 h，連續(xù)照射7 d，照射期間正常進食與飲水。光照結(jié)束后進行視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）和光學(xué)相干斷層成像（optical coherence tomography，OCT）等生理指標(biāo)檢測。

其中，模型制備在無自然光干擾下進行。將光照器放在有自動調(diào)溫功能的箱體中，懸掛于小鼠頂端50 cm處，采用垂直照射方式照射，排除溫度升高引起小鼠視網(wǎng)膜光熱損傷的可能。

1.5 體重及攝食量記錄

體重及攝食量自給藥開始后進行記錄，其中，體重每周稱量1次。攝食量每天記錄1次，最后計算8周以來總的均值。

1.6 視網(wǎng)膜電圖檢測

ERG是由光誘發(fā)的電生理反應(yīng)。C57BL/6J小鼠的視網(wǎng)膜以視桿細胞為主，0.01 cd/m2下的b波反映小鼠視桿系統(tǒng)的功能，3.0 cd/m2下的b波反映視網(wǎng)膜雙極細胞的功能，因此，本實驗以視網(wǎng)膜電圖中的b波來判斷視網(wǎng)膜功能的受損程度。

小鼠在檢查前進行避光處理12 h。配制5%的水合氯醛溶液，采用0.01 mL/g體重的劑量對小鼠進行腹腔注射，麻醉后用0.1 mg/mL硫酸阿托品滴眼液進行散瞳處理。整個實驗過程在紅光下進行，記錄視網(wǎng)膜電圖，記錄電極為角膜環(huán)形電極，參考電極接近眼的面部皮膚，接地電極接尾部。電位放大器的通頻帶寬為0.3 Hz～300 Hz。實驗結(jié)束后對小鼠眼球表面涂抹氧氟沙星眼膏，防止眼球長時間干燥引起小鼠眼球脫水。

1.7 光學(xué)相干斷層成像

麻醉方法同1.6，小鼠經(jīng)水合氯醛溶液腹腔注射后麻醉。待小鼠四肢無反應(yīng)并脊背無弓起現(xiàn)象后將其放置于固定架上，滴加散瞳藥，然后將小鼠右眼球與鏡面緊貼，眼球位置擺正后進行觀察。實驗結(jié)束后迅速涂抹眼膏，防止眼球長時間暴露于空氣中引起眼球脫水。

1.8 視網(wǎng)膜組織氧化指標(biāo)檢測

參照陳春艷等[11]的研究方法，取各組小鼠眼球，體式顯微鏡下分離視網(wǎng)膜，并制備視網(wǎng)膜組織勻漿。根據(jù)試劑盒說明檢測各項指標(biāo)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果分析

2.1 體重與攝食量

小鼠體重與攝食量見表1。

表1 體重與攝食量Table 1 Body weight and food intake

如表1所示，各組小鼠初始體重較模型組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。從最終體重上看，藥物干預(yù)組體重較正常組和模型組有所下降，與模型組比較，GQL、GQM、GQH均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。從攝食量上來看，各組動物攝食量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 ERG結(jié)果分析

ERG結(jié)果分析見圖1。

圖1 視網(wǎng)膜電生理b波振幅Fig.1 ERG b-wave amplitude of retina in each group

如圖1所示，ERG的振幅越高，說明小鼠眼球?qū)獾姆磻?yīng)越敏感，屬于一種功能性檢測。比較0.01 b波和3.0 b波處各組動物，藥物干預(yù)組振幅高于模型組。從 0.01 b波來看，NOR、MOD、GQL、GQM 和 GQH 組振幅分別為（59.38±2.35）、（50.49±3.12）、（53.55±1.12）、（54.26±3.26）μV 和（55.12±2.38）μV，與模型組比較，枸杞子低、中、高劑量組振幅顯著升高（P＜0.05）。從3.0 b波上看，NOR、MOD、GQL、GQM和GQH組振幅分別為 （57.48±5.2）、（48.12±3.12）、（52.58±4.8）、（54.42±3.28）μV 和（55.25±4.26）μV，說明枸杞多糖粗提物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜具有修復(fù)作用，并且粗提物的劑量越高，其修復(fù)效果越好。

2.3 OCT結(jié)果分析

光學(xué)相干斷層掃描法是利用眼內(nèi)不同組織對光的反射性的不同，分析出不同組織的結(jié)構(gòu)及其厚度，結(jié)果見圖2和表2。

從OCT偽彩圖中可以看到，損傷后RPE層出現(xiàn)明顯病變，其組織較正常組表面更加粗糙。如圖2所示，與模型組比較，枸杞子低、中、高劑量組的RPE層均較模型組表面光滑。另外，光損傷組ONL厚度明顯變?。ū?），枸杞多糖粗提物干預(yù)后，ONL層厚度明顯增加（P＜0.05），表明枸杞多糖粗提物具有預(yù)防視網(wǎng)膜RPE層損傷的作用。

2.4 枸杞多糖粗提物對小鼠視網(wǎng)膜組織中MDA含量的影響

在過量光照環(huán)境中視網(wǎng)膜會發(fā)生脂質(zhì)過氧化，會產(chǎn)生大量的活性醛類物質(zhì)，使視網(wǎng)膜的脂類受到不可逆損傷[12]，枸杞多糖粗提物對小鼠視網(wǎng)膜組織中MDA含量的影響見圖3。

圖2 不同組別的OCT偽彩圖Fig.2 OCT pseudo-color images of different groups

表2 視網(wǎng)膜ONL層厚度比較Table 2 Comparison of retinal ONL thickness

圖3 提取物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織MDA含量的影響Fig.3 Effects of the extract on MDA content of retinal tissues of light-damaged mice

圖3表明，NOR組和MOD組MDA含量分別為（1.5±0.3）nmol/mg和（5.21±0.66）nmol/mg。光照能引起小鼠視網(wǎng)膜組織中MDA含量顯著增加，而攝入低、中、高劑量枸杞多糖粗提物后，與模型組相比，MDA含量分別下降13.6%、16.5%和18.4%。其中，與模型組相比較，受試物低、中、高劑量組較模型組具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

2.5 枸杞多糖粗提物對視網(wǎng)膜組織中SOD活力的影響

SOD作為一種抗氧化酶，對視網(wǎng)膜具有一定的保護作用[13]，枸杞多糖粗提物對視網(wǎng)膜組織中SOD活力的影響見圖4。

圖4 提取物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織SOD活力的影響Fig.4 Effects of the extract on SOD activity of retinal tissue of light-damaged mice

圖4結(jié)果表明，NOR組和MOD組SOD活力分別為（9.84±0.58）U/mg和（5.21±0.66）U/mg。光照導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜組織中產(chǎn)生了自由基代謝失衡現(xiàn)象。而攝入低、中、高劑量枸杞多糖粗提物的小鼠，與模型組相比，SOD活力分別增加14.8%、17.5%和22.8%，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

2.6 枸杞多糖粗提物對小鼠視網(wǎng)膜組織中CAT活力的影響

CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶系之一，具有抑制自由基損傷關(guān)鍵性亞細胞結(jié)構(gòu)的作用[14]，枸杞多糖粗提物對小鼠視網(wǎng)膜組織中CAT活力的影響見圖5。

圖5 提取物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織CAT活力的影響Fig.5 effects of the extract on CAT activity of retinal tissue of light-damaged mice

如圖5所示，NOR組和MOD組CAT活力分別為（25.38±1.21）U/mg和（15.21±1.06）U/mg，與正常組比較，光損傷小鼠CAT活力下降40.1%（P＜0.05）；攝入低、中、高劑量枸杞多糖粗提物后，與模型組相比CAT活力分別增加 17.6%、20.0%和32.2%（P＜0.05）。

2.7 枸杞多糖粗提物對視網(wǎng)膜組織中GSH-Px活力的影響

抗氧化物酶活力的高低反映了機體清除氧自由基的能力[15]，枸杞多糖粗提物對視網(wǎng)膜組織中GSH-Px活力的影響見圖6。

圖6 提取物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織GSH-Px活力的影響Fig.6 effects of the extract on GSH-Px activity of retinal tissue of light damaged mice

圖6結(jié)果表明，NOR組和MOD組GSH-Px活力分別為（10.25±1.12）U/mg 和（6.02±0.68）U/mg。與正常組相比，光損傷模型小鼠視網(wǎng)膜中GSH-Px活力顯著下降（P＜0.05），低、中、高劑量模型小鼠中 GSH-Px活力與模型組比較，分別增加27.6%、37.2%和49.5%，具有劑量效應(yīng)關(guān)系。其中，與模型組比較，枸杞多糖粗提物干預(yù)組均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.8 枸杞多糖粗提物對視網(wǎng)膜組織中T-AOC的影響

在機體防御機制中，T-AOC能反映動物機體的總抗氧化狀態(tài)[16]，枸杞多糖粗提物對視網(wǎng)膜組織中T-AOC的影響見圖7。

圖7 提取物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織T-AOC的影響Fig.7 effects of the extract on T-AOC of retinal tissue of light damaged mice

圖7結(jié)果表明，NOR組和MOD組T-AOC分別為（3.2±0.12）U/mg和（1.4±0.14）U/mg，與正常組相比，光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織中T-AOC顯著下降（P＜0.05），低、中、高劑量模型小鼠中T-AOC與模型對照組比較，分別增加12.9%、15.7%和22.1%，具有劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

水提醇沉法是植物活性成分提取的一個常用方法，可以將枸杞子中的活性功能成分進行有效提取。枸杞多糖粗提物的功能成分比較復(fù)雜，一般認為其中起主要抗氧化作用的成分為枸杞多糖[17]，并且發(fā)現(xiàn)枸杞多糖的保護作用可能與下調(diào)視網(wǎng)膜Nrf2等抗氧化基因的表達有關(guān)[18]。同時，與枸杞多糖一起被提取出來的包括水溶性淀粉與蛋白質(zhì)，還有微量的鞣質(zhì)、色素和無機鹽等。張兆旺等[19]對水提醇沉的工藝研究發(fā)現(xiàn)，其有效成分的提取受醇沉中乙醇含量的影響較大。當(dāng)醇沉過程中乙醇含量達到50% ～60%時，可以使淀粉發(fā)生沉淀，當(dāng)含醇量達到75%以上時，除鞣質(zhì)和水溶性色素等無效成分外，全部淀粉、多糖、蛋白質(zhì)和無機鹽類被沉淀下來。

視網(wǎng)膜是眼球的重要組成部分，大多數(shù)視力疾病的發(fā)生都與視網(wǎng)膜的功能和形態(tài)異常有關(guān)。視網(wǎng)膜是一個多層細胞結(jié)構(gòu)，小膠質(zhì)細胞穿梭現(xiàn)象是視網(wǎng)膜出現(xiàn)病變的重要表征。有研究發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，小膠質(zhì)細胞主要存在于外核層（outer nuclear layer，OPL），但長時間的強光刺激后，小膠質(zhì)細胞開始逐漸向ONL層遷移，可能與兩層之間的細胞膜屏障被破壞有關(guān)，經(jīng)常有視網(wǎng)膜萎縮的情況發(fā)生[20]。這與本研究的OCT實驗結(jié)果是相互印證的。通過OCT和ERG實驗發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠視網(wǎng)膜相比，接受強光刺激的小鼠視網(wǎng)膜ONL層出現(xiàn)了明顯萎縮，并且視網(wǎng)膜電圖中b波振幅明顯降低。與模型組小鼠相比，枸杞子干預(yù)組小鼠的視網(wǎng)膜得到了明顯的改善。

視網(wǎng)膜最外層細胞為RPE層細胞，是光線的主要吸收部位，但長時間接受強光刺激會促使抗過氧化物酶的活性降低，導(dǎo)致RPE細胞損傷、凋亡，甚至壞死，進而引發(fā)眼部疾病[21-23]。通過對視網(wǎng)膜酶活的研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖粗提物明顯增強了視網(wǎng)膜中抗氧化酶的活力，在實驗劑量組范圍內(nèi)呈現(xiàn)出量效關(guān)系，且低劑量組即可起效，提示枸杞多糖粗提物可增強視網(wǎng)膜的抗氧化能力，減輕過量活性氧自由基對視網(wǎng)膜組織造成的損傷。

綜合ERG的b波數(shù)據(jù)及OCT成像檢測，與模型組比較，低、中、高劑量組的枸杞多糖粗提物均可對視網(wǎng)膜損傷起到保護作用，并且在本實驗給藥的劑量范圍內(nèi)隨著枸杞多糖粗提物劑量的提高而升高，具有一定的劑量依賴性。總的來說，枸杞子的攝入能夠增強機體的抗氧化作用，可在后續(xù)研究中對枸杞子中的功能成分進一步進行分離，以期為枸杞子視力保護產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。