岳影星 楊舟鑫 盧艷 嚴(yán)靜,

膿毒癥是指宿主對感染反應(yīng)失控而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。其中，心臟功能障礙是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的重要因素之一[2]。目前對膿毒癥狀態(tài)下心臟變化的認(rèn)識仍然比較初步，但在發(fā)生膿毒癥時，心肌組織的局部炎癥被認(rèn)為是膿毒癥心功能異常的關(guān)鍵因素之一。膿毒癥狀態(tài)下，心臟組織會發(fā)生免疫細(xì)胞的浸潤，這些免疫細(xì)胞分泌高水平的炎癥因子如TNF-α 和IL-1β，從而影響心臟的生理功能[3]。

內(nèi)皮功能改變是膿毒癥狀態(tài)下心肌炎癥的重要誘因，而大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat cardiac microvascular endothelial cells，rCMECs）狀態(tài)的變化被認(rèn)為是膿毒癥內(nèi)皮功能改變的關(guān)鍵。在正常狀態(tài)下，心臟內(nèi)皮細(xì)胞可以起到很好的屏障作用；但是在膿毒癥狀態(tài)下，心肌內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用降低，炎癥細(xì)胞進(jìn)入心肌組織而導(dǎo)致心臟功能異常[4]。除了屏障作用之外，內(nèi)皮細(xì)胞在病原微生物和炎癥因子的刺激下，分泌趨化因子和黏附蛋白，吸引和協(xié)助炎性細(xì)胞進(jìn)入組織中[5-6]。因此，對于rCMECs 在膿毒癥中變化的研究對于膿毒癥心肌保護(hù)具有重要的意義。本文對革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁關(guān)鍵成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理的rCMECs細(xì)胞模型進(jìn)行了的轉(zhuǎn)錄組分析，從全局的角度探索了膿毒癥rCMECs 的變化，以期為膿毒癥心肌保護(hù)提供新的提示。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：1月齡的雄性SD大鼠10只，SPF級別飼養(yǎng)，體質(zhì)量（100±5）g，質(zhì)量合格證編號：NO1612060018，從浙江省醫(yī)科院動物實驗中心購買。

2.試劑：內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（含有雙抗，內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑和胎牛血清，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為M199 培養(yǎng)基）（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶和LPS（美國Sigma公司）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buff er solution，PBS）和0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；Trizol（美國Thermo公司），miRNeasy Mini Kit（德國Qiagen公司），Next rRNA Depletion Kit（英國NEB公司），ReverTra Ace qPCR RT Kit 和SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）。

二、方法

1.rCMECs 的分離培養(yǎng)：根據(jù)課題組以前的方案分離rCMECs[7]。1月齡雄性SD 大鼠處死后打開胸腔，取出心臟，使用PBS 清洗心臟并排出血液。取出心臟組織，棄去結(jié)締組織，放入75 %酒精中浸泡30 s 然后泡入完全培養(yǎng)基。使用剪刀盡量減碎心臟組織，用PBS 清洗，加入兩倍體積0.2 %Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫振蕩15 min，加入相同體積的完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用200 目濾網(wǎng)過濾，300×g離心5 min，PBS 清洗1次，然后接種到1 %明膠包被的6 cm 的培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，放入含有5 %CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 h后換液，去掉沒有貼壁的細(xì)胞。培養(yǎng)5 d 左右細(xì)胞融合度＞ 80 %。消化時使用含0.02 %EDTA 的0.25 %胰酶消化，消化至細(xì)胞即將脫落的狀態(tài)時，加入1 mL 完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。然后加入3 mL 的PBS，用移液器反復(fù)吹打細(xì)胞至大部分細(xì)胞從培養(yǎng)皿脫落。300×g離心5 min后棄去上清液，加入內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3 的比例傳代擴(kuò)增。實驗使用3 代以內(nèi)的rCMECs。

2.LPS 處理rCMECs：消化rCMECs，每孔接種3×105個細(xì)胞至6 孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后，按終濃度100 ng/mL 加入LPS。對照組和LPS 各有3個生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)文獻(xiàn)報道LPS 處理6 h 的內(nèi)皮細(xì)胞有多個指標(biāo)具有較顯著的變化[8]，因此選擇LPS 處理rCMECs 6 h，棄去上清后用PBS 清洗1遍后，加入trizol 吹打幾次后放入-80℃冰箱用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序或者定量PCR。

3.轉(zhuǎn)錄組測序：轉(zhuǎn)錄組測序在上海金特達(dá)公司進(jìn)行?？俁NA 使用miRNeasy Mini Kit 提取，然后使用Next rRNA Depletion Kit 來去除核糖體RNA。RNA 測序是在Illumina 的HiSeq X-Ten nextgeneration 上進(jìn)行。采用STRINGTIE 軟件計算每個基因測到的計數(shù)。本文主要關(guān)注mRNA，DESeq 軟件用來計算差異基因。

4.GO 和KEGG富集和基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析：上調(diào)基因和下調(diào)基因的基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析是使用基于R 語言的The Hypergeometric Distribution 來進(jìn)行。將GO富集中P值最小的前10個關(guān)于生物學(xué)過程（biological processes）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）的富集以及KEGG富集中P值最小前20個的通路以圖的形式展示?；蚬脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)是通過差異基因的結(jié)果及其表達(dá)值構(gòu)建，并分析這些基因的表達(dá)調(diào)控。

5.RNA 逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR：使用Rever Tra Ace qPCR RT Kit 進(jìn)行mRNA 逆轉(zhuǎn)錄，然后使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 進(jìn)行定量PCR 分析。定量PCR 時使用Gapdh 的表達(dá)量作為內(nèi)參。計算目的基因與Gapdh 的ΔCt 值，然后按照2-ΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。（表1）

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。Mt2a、Sod2、Ccl2、Cxcl1、Icam1、Vcaml基因的mRNA表達(dá)水平以x± s表示，采用獨(dú)立t檢驗，以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LPS 處理調(diào)控了心肌功能相關(guān)基因的改變

分析了其中編碼蛋白質(zhì)的mRNA 的變化。在LPS 處理下，有265個基因被檢測到表達(dá)上調(diào)，有118個基因的表達(dá)下調(diào)（圖1）。最顯著上調(diào)前10個 基 因 為：Mt2a、Cyp7b1、Sod2、Icam1、Ccl2、AC128848.1、Mt1、Cebpd、Serpinb2和Tnfrsf11b。最顯著下調(diào)前10個基因為：Cavin2、Ankrd1、Edn1、Prss35、Lmod1、Dhrs3、Ttc22、Sema6a、Map2k3和Sema7a。上調(diào)基因中，選擇了與氧化應(yīng)激（Mt2a、Sod2）、趨化因子（Ccl2、Cxcl1）和細(xì)胞表面黏附（Vcam1、Icam1）相關(guān)的幾個基因進(jìn)行了定量PCR驗證。定量PCR 的結(jié)果表明這幾個基因在LPS 的處理下均上調(diào)，與測序的結(jié)果相符。下調(diào)基因中，選擇了Cavin2、Ankrd1、Edn1和Prss35進(jìn)行了驗證，定量PCR 的結(jié)果表明這幾個基因均下調(diào)。（表2）

表1 引物序列信息

圖1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果火山圖

二、差異基因GO富集分析

上調(diào)基因從生物學(xué)角度，前3個是對LPS 的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)和細(xì)胞運(yùn)動的正調(diào)節(jié)。而從細(xì)胞內(nèi)成分角度，前3個是I-κB/NF-κB 復(fù)合物、核周體和質(zhì)膜外側(cè)。從分子功能的角度，上調(diào)基因前3個富集是趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合和細(xì)胞因子活性。（圖2）

對于下調(diào)的基因，從生物學(xué)過程角度，GO富集最顯著的是磷脂酶C 激活G蛋白偶聯(lián)信號通路中胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控、鈣離子穩(wěn)態(tài)和胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)節(jié)。而從細(xì)胞內(nèi)成分角度，GO富集中P值最小的3個是基底外側(cè)質(zhì)膜、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白復(fù)合物。從分子功能的角度，前3個是G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、睪酮脫氫酶（NAD+）活性、G蛋白β 亞單位結(jié)合。（圖3）

三、差異基因KEGG 功能分析

上調(diào)基因KEGG富集前3個是腫瘤壞死因子信號通路、NF-κB 信號通路和病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用。（圖4）

表2 差異基因定量PCR 驗證（± s）

表2 差異基因定量PCR 驗證（± s）

注：對照組Ankrd1，Edn1 的實驗次數(shù)為2次

分組 實驗次數(shù) Mt2a Sod2 Ccl2 Cxcl1 Icam1對照組 3 0.084473±0.004400 0.007357±0.000623 0.000378±0.000039 0.001666±0.000144 0.019167±0.002541 LPS 組 3 1.445459±0.372817 0.076643±0.003449 0.084866±0.004514 0.239796±0.027300 0.075535±0.006341 t 值 6.322 34.230 32.410 15.110 14.290 P 值 0.003 ＜ 0.001 ＜ 0.001 0.001 0.001分組 實驗次數(shù) Vcaml Cavin2 Ankrd1 Edn1 Prss35對照組 3 0.000021±8.48873E-06 0.041950±0.018844 0.115589±0.014128 0.026018±0.007298 0.001844±0.000018 LPS 組 3 0.002501±0.000030 0.009144±0.000279 0.057983±0.003549 0.005615±0.001817 0.000632±0.000297 t 值 137.200 3.015 7.290 5.003 5.472 P 值 ＜ 0.001 0.039 0.005 0.015 0.012

圖2 上調(diào)基因GO富集分析

圖3 下調(diào)基因GO富集分析

下調(diào)基因KEGG富集前3個是神經(jīng)活性配體-受體相互作用、黑色素生成和肌醇磷酸鹽代謝。（圖5）

四、差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

如圖6所示，SOD2 處于差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的核心位置，其可能在LPS 誘導(dǎo)的rRCMECs 功能改變中有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。

討 論

LPS 體外刺激實驗方法，被認(rèn)為是可以用來模擬革蘭氏陰性菌感染下的細(xì)胞的變化情況，而一般研究較多的是巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，在LPS 處理后，大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞大量基因的表達(dá)發(fā)生了變化，很多與氧化應(yīng)激、趨化因子和細(xì)胞表面黏附相關(guān)的基因的表達(dá)都明顯上調(diào)。利用生物信息學(xué)技術(shù)的分析，本研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化確實與心臟內(nèi)皮功能紊亂有密切的相關(guān)性。與其他細(xì)胞受到LPS 刺激后一樣，rCMECs上調(diào)了大量與NF-κB 信號通路有關(guān)的基因表達(dá)，如Cxcl1、Nfkbia、Vcam1、Icam1等基因的表達(dá)都明顯上調(diào)。與利用LPS 處理巨噬細(xì)胞實驗不一樣的是，本實驗并沒有發(fā)現(xiàn)炎癥因子Tnf和Il6表達(dá)的明顯變化。通常認(rèn)為分泌炎癥因子并非內(nèi)皮細(xì)胞的主要功能，反而是趨化因子、黏附分子的上調(diào)對于內(nèi)皮細(xì)胞功能的改變具有更加重要的意義。CXCL1 和CCL2兩個趨化因子在基因表達(dá)水平有明顯的上升，其中CXCL1 是一種粒細(xì)胞的趨化因子[9]，CCL2 是一種重要的單核細(xì)胞趨化因子[10]。VCAM1 和ICAM1是細(xì)胞表面重要的黏附分子，對淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或粒細(xì)胞有黏附作用，它們的基因表達(dá)也顯著上升[11-12]。這些改變與內(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥狀態(tài)下的改變一致，即內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子可以吸引炎性單核細(xì)胞、中心粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞到血管內(nèi)皮周圍，然后通過表面的黏附分子黏附這些細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到組織中從而引起組織的炎癥反應(yīng)。

圖4 上調(diào)基因KEGG富集分析

對于下調(diào)基因的分析表明，鈣離子信號和G蛋白相關(guān)通路的基因表達(dá)明顯下調(diào)，這兩個通路被認(rèn)為可能與細(xì)胞骨架形成有密切的關(guān)聯(lián)[13-14]。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞可以依靠骨架蛋白呈現(xiàn)特定的形態(tài)；但是在膿毒癥引發(fā)的內(nèi)皮損傷過程中，細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞。同時鈣離子信號也是VE-cadherin 重要的調(diào)節(jié)信號，膿毒癥狀態(tài)下VE-cadherin 的內(nèi)化會導(dǎo)致心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞依靠VE-Cadherin 形成的嗜同性結(jié)合被破壞[15]。細(xì)胞骨架蛋白和VE-cadherin 的異常，會導(dǎo)致rCMECs 之間的間隙變大，內(nèi)皮通透性增加而引起炎癥細(xì)胞浸潤[16]。

這些結(jié)果說明內(nèi)皮很多功能改變可以直接由LPS 誘導(dǎo)產(chǎn)生，而不依賴于炎癥因子的持續(xù)高表達(dá)。在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中，循環(huán)中的炎癥因子并非持續(xù)高表達(dá)；即使進(jìn)入了膿毒癥后期免疫抑制狀態(tài)，內(nèi)皮功能仍會有異常，這一臨床和動物層次的表現(xiàn)與本文的結(jié)果有很好的一致性。感染狀態(tài)下病原微生物除了刺激免疫細(xì)胞，對內(nèi)皮細(xì)胞的直接刺激也是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

對差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析表明Sod2處于核心位置。Sod2即人超氧化物歧化酶-2，可以催化超氧化物為過氧化氫，是降低體內(nèi)活性氧的關(guān)鍵酶之一，而高活性氧也是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中對機(jī)體造成損傷的關(guān)鍵因素之一。在LPS 處理后，rCMECs 中Sod2基因表達(dá)的上升也是對活性氧上升的一種反應(yīng)。然而，Sod2處于差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的核心位置說明它可能影響了rCMECs 中很多生物學(xué)過程。其具體的作用可能需要進(jìn)一步的功能研究?？傊疚膹娜值慕嵌葘PS 誘導(dǎo)的rCMECs 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)LPS 可以調(diào)控氧化應(yīng)激、趨化因子和黏附分子等相關(guān)基因的表達(dá)，且基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的分析提示Sod2可能是心肌功能異常的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。本研究的結(jié)果為膿毒癥狀態(tài)下內(nèi)皮損傷的研究提供了新的線索。

圖5 下調(diào)基因KEGG富集分析

圖6 差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖