馮曉玲 高鴻亮

炎癥性腸?。╥nf lammatory bowel disease，IBD）分為潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩病，是特發(fā)性腸道炎癥疾病，具有發(fā)病早、病程緩和易復(fù)發(fā)特點(diǎn)，患者發(fā)病后需要接受長(zhǎng)時(shí)間治療，嚴(yán)重影響患者正常生活[1]。目前僅了解IBD 發(fā)病主要由遺傳、腸道細(xì)菌、環(huán)境以及腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)等眾多因素一同導(dǎo)致[2]。炎癥反應(yīng)過(guò)程與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能關(guān)系密切，探究腸道炎癥發(fā)生時(shí)機(jī)體免疫功能變化對(duì)于了解腸道炎癥疾病合理免疫治療方案制定具有重要意義。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）可通過(guò)細(xì)胞之間相互作用與因子釋放達(dá)到減少輔助T細(xì)胞增殖、抑制促炎因子分泌、減少免疫損傷和鞏固免疫耐受的目的[3]。ω-3 多不飽和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs）作為人體正常運(yùn)轉(zhuǎn)必需脂肪酸之一，其主要由二十碳五烯酸與二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）組成，不僅可以為機(jī)體提供能量，還可以作為藥物治療自身免疫性疾病，甚至能夠抑制T細(xì)胞及淋巴細(xì)胞增殖[4]。本研究以IBD 小鼠為模型，進(jìn)一步明確ω-3 PUFAs對(duì)IBDTreg細(xì)胞的影響。

材料和方法

一、材料

1.動(dòng)物和試劑：小鼠來(lái)自新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院動(dòng)物研究中心，三硝基苯磺酸、維甲酸（美國(guó)Sigma公司），ω-3 PUFAs、DHA、飽和脂肪酸硬脂酸（美國(guó)Peprotech公司），RPMI- 1640 培養(yǎng)基、PBS 磷酸鹽緩沖液（上海士峰生物科技有效公司），胎牛血清（美國(guó)Thermo Scientif ic公司），annexinV- FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司），F(xiàn)ITC- anti-CD4、

PE- ant- CTLA- 4、APC-anti-Foxp3、PE-anti- CD39、PE- anti- CD25、anti-CD3、anti-CD28 單克隆抗體、固定/通透液、高爾基體阻斷劑BD Golgistop 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（丹麥eBioscience公司），鼠CD4+CD25+Treg 分離試劑盒（上海強(qiáng)智生物科技有限公司），TGF-β、IL-2（南京歐凱生物公司），CFSE 及anti-CD3/CD28 beats（美國(guó)Gibcolifetechnologies 公司），白介素-10（IL-10）、Foxp3 以及干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。

2.儀器：FYL-YS-150L型號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國(guó)北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司），MA100型號(hào)倒置顯微鏡（日本尼康公司），LDZ5-2型號(hào)離心機(jī)（中國(guó)北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），Accuri C6型號(hào)流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

二、方法

1.動(dòng)物分組以及處理：120 只雄性健康Balb/C小鼠均為SPF級(jí)別，5～9 周齡，平均為（6.14±0.82）周，體質(zhì)量17～22 g，平均（20.51±0.47）g，小鼠均給予質(zhì)量體積為1%三硝基甲苯30%乙醇溶液處理，以形成IBD 小鼠模型，三硝基甲苯乙醇溶液處理濃度為100 mg/kg。隨后將所有小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分組方法分為4 組，分別以2.5g/（kg·d）濃度腹腔注射ω-3 PUFAs（ω-3 PUFAs組）、飽和脂肪酸硬脂酸（硬脂酸對(duì)照組）、DHA（DHA 組），同時(shí)設(shè)置注入相同濃度生理鹽水作為空白對(duì)照組，隨后小鼠均連續(xù)注入14 d。14 d后將小鼠處死，部分結(jié)腸采用甲醛固定用于組織學(xué)分析，部分則用于Treg細(xì)胞功能檢測(cè)。

2.組織學(xué)分析：結(jié)腸組織應(yīng)用10%甲醛固定后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片以及染色處理，最后采用相關(guān)文獻(xiàn)[5]進(jìn)行評(píng)分以及組織學(xué)分析。

3.Treg細(xì)胞水平測(cè)定：小鼠結(jié)腸組織研磨后應(yīng)用100 目篩網(wǎng)過(guò)濾后獲取細(xì)胞懸液，隨后經(jīng)由裂解后離心并采用PBS 清洗3次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為6×105個(gè)/mL，添加PE-CD25 抗體，在4℃環(huán)境下進(jìn)行避光孵育30 min。胞內(nèi)細(xì)胞因子染色分析需要在培養(yǎng)完成4～6 h 給予蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑以阻斷處理，添加標(biāo)準(zhǔn)為含有106個(gè)細(xì)胞2 mL 培養(yǎng)液需要添加4 μL 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑。避光孵育結(jié)束后采用PBS 進(jìn)行1～2次洗滌后應(yīng)用200 μL 固定/通透液處理，此過(guò)程需要在4℃環(huán)境下避光30 min，結(jié)束后應(yīng)用通透洗滌液進(jìn)行2次洗滌，采用通透液（100 μL）重懸，并加入細(xì)胞因子與表型分析抗體PE- anti- Foxp3，同樣在4℃環(huán)境下避光孵育30 min，結(jié)束后應(yīng)用通透液洗滌，最終采用PBS（200 μL）重懸后選擇流式細(xì)胞儀予以檢查并分析。

4.細(xì)胞內(nèi)因子mRNA表達(dá)水平測(cè)定：檢測(cè)使用Real- time PCR，應(yīng)用Trizol 法對(duì)nTregs 與iTregs細(xì)胞總RNA 進(jìn)行抽提與純化，隨后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其作為模板予以PCR 擴(kuò)增。Real-time PCR 操作參照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，1 μL cDNA 對(duì)應(yīng)10 μL PCR 引物，反應(yīng)條件設(shè)置為95℃進(jìn)行預(yù)變性，時(shí)間為30 s，95℃持續(xù)30 s，最終為60℃ 30 s，一共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參選擇GAPDH，并應(yīng)用 2-ΔΔCT計(jì)算對(duì)應(yīng)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

5.細(xì)胞因子水平測(cè)定：將小鼠結(jié)腸組織制成組織勻漿，隨后采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定上清液中IL- 10、Foxp3 以及IFN-γ 水平，檢測(cè)按照對(duì)應(yīng)試劑盒進(jìn)行操作。

6.觀察指標(biāo)：比較各組小鼠組織學(xué)評(píng)分，Treg細(xì)胞表型，細(xì)胞內(nèi)部因子mRNA表達(dá)水平，上清液中細(xì)胞因子水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料如小鼠組織學(xué)評(píng)分、Treg細(xì)胞表型比例、細(xì)胞內(nèi)部因子mRNA表達(dá)水平、上清液中細(xì)胞因子水平均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差比較，兩兩比較應(yīng)用SNK 檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠結(jié)腸組織組織學(xué)分析

空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸觀察到顯著水腫、充血和糜爛，上皮細(xì)胞可以觀察到明顯潰瘍以及壞死，有明顯淋巴細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，硬脂酸對(duì)照組、DHA 組與ω-3 PUFAs組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度逐漸減輕，可以觀察到少量淋巴組織增生周圍組織可見(jiàn)明顯黏連（圖1）。與空白對(duì)照組比較，硬脂酸對(duì)照組、DHA 組與ω-3 PUFAs組小鼠組織學(xué)評(píng)分 [（4.12±0.89）分 比（3.82±0.51）分、（2.51±0.74）分、（1.04±0.36）分]均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 137.469，P＜ 0.05），各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），僅空白對(duì)照組與硬脂酸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

二、各組Treg細(xì)胞表型比例比較

與空白對(duì)照組比較，硬脂酸對(duì)照組、DHA組與ω-3 PUFAs組Treg細(xì)胞表型比例[（3.80±0.89）%比（3.90±0.75）%、（7.22±1.13）%、（10.10±1.29）%] 均升高，與空白對(duì)照組比較，硬脂酸對(duì)照組、DHA 組以及ω-3 PUFAs組Treg細(xì)胞表型比例升高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 304.301，P＜0.05），各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），其中僅空白對(duì)照組與硬脂酸對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖2）。

三、各組細(xì)胞內(nèi)部因子mRNA表達(dá)水平比較

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察四組小鼠結(jié)腸組織病理情況（HE染色，×400）

圖2 四組Tr eg細(xì)胞表型檢測(cè)

與空白對(duì)照組比較，ω-3 PUFAs組、硬脂酸對(duì)照組、DHA 組細(xì)胞內(nèi)部Foxp3、IL-10 mRNA表達(dá)水平均升高（P＜ 0.05），與硬脂酸對(duì)照組比較，ω-3 PUFAs組 與DHA 組 細(xì) 胞 內(nèi) 部Foxp3、IL-10 mRNA表 達(dá)水平均升高，且ω-3 PUFAs組高于DHA 組（P均＜0.05，表1）。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)部因子mRNA表達(dá)水平比較（± s）

表1 各組細(xì)胞內(nèi)部因子mRNA表達(dá)水平比較（± s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05，與硬脂酸對(duì)照組比較，bP ＜ 0.05，與DHA 組比較，cP ＜ 0.05

分組例數(shù) Foxp3 IL-10空白對(duì)照組 30 96.74 ± 6.65 0.59 ± 0.18硬脂酸對(duì)照組 30 107.33 ± 6.82a 0.98 ± 0.29a DHA 組 30 122.67 ± 8.53ab 1.22 ± 0.59ab ω-3 PUFAs組 30 165.22 ± 10.43abc 1.47 ± 0.53abc F 值 399.211 22.584 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

四、各組上清液中細(xì)胞因子水平比較

與空白對(duì)照組比較，ω-3 PUFAs組、硬脂酸對(duì)照組、DHA 組上清液中細(xì)胞因子IL-10、Foxp3 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05），與硬脂酸對(duì)照組比較，ω-3 PUFAs組與DHA 組上清液中細(xì)胞因子IL-10、Foxp3 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05），與DHA 組 比較，ω-3 PUFAs組上清液中IL-10、Foxp3 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05，表2）。

表2 各組上清液中細(xì)胞因子水平比較（± s）

表2 各組上清液中細(xì)胞因子水平比較（± s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與硬脂酸對(duì)照組比較，bP ＜ 0.05；與DHA 組比較，cP ＜ 0.05

分組例數(shù) IL-10（pg/mL）Foxp3（ng/mL）IFN-γ（pg/mL）空白對(duì)照組 30 83.51± 4.67 9.65 ± 1.29 203.51 ± 10.29硬脂酸對(duì)照組 30 108.35 ± 7.22a 13.73 ± 1.32a 165.32 ± 11.67a DHA 組 30 122.29 ± 15.33ab 15.67 ± 2.57ab 128.34 ± 6.77ab ω-3 PUFAs組 30 153.67 ± 15.28abc 19.53 ± 2.18abc 105.29 ± 6.81abc F 值 189.451 137.366 665.863 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

討 論

IBD 為胃腸道組織出現(xiàn)慢性炎癥性疾病，目前認(rèn)為其發(fā)病主要由胃腸道免疫功能損傷以及黏膜反應(yīng)過(guò)度所致。已有研究證實(shí)Treg細(xì)胞是保證機(jī)體免疫耐受的重要細(xì)胞，其功能障礙或者數(shù)量減少會(huì)導(dǎo)致IBD 發(fā)生[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更是進(jìn)一步證實(shí)將CD4+CD25-T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T 淋巴功能障礙小鼠體內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)一系列自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IBD 等，而將CD4+CD25+T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移給同樣小鼠，其免疫缺陷疾病則可以有效避免[8]。因此，IBD 治療應(yīng)以糾正患者免疫功能紊亂，改善Treg細(xì)胞水平為主。

ω-3PUFAs 主要由EPA 與DHA 組成，其中EPA可以有效促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)過(guò)度，改善免疫功能，DHA 為膜磷脂形成重要組成，對(duì)細(xì)胞膜具有保護(hù)穩(wěn)定作用[9]。研究顯示癌癥患者Treg細(xì)胞水平異常上升，患者通過(guò)攝入ω-3PUFAs可以抑制Tregs細(xì)胞功能，減少細(xì)胞對(duì)免疫抑制相關(guān)因子釋放，間接改善B細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞以及CD8+細(xì)胞功能，糾正機(jī)體免疫紊亂達(dá)到抗腫瘤作用[10]。IBD 發(fā)病則主要是由Tregs細(xì)胞減少以及功能異常所致，所以其治療應(yīng)以促進(jìn)Treg細(xì)胞成熟與分化，改善其功能為主。已有研究證實(shí)IBD患者外周血Treg細(xì)胞水平明顯少于健康者，而在炎癥恢復(fù)期患者Treg細(xì)胞水平與健康者差異逐漸減少，顯示患者炎癥緩解主要為Tregs細(xì)胞被募集至炎癥位置發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]。Foxp3 是反映Tregs細(xì)胞功能成熟作用特異性標(biāo)記物，Treg細(xì)胞逐漸增加結(jié)直腸癌患者病灶組織中Foxp3+Tregs表達(dá)增加，而攝入高劑量ω-3PUFAs 結(jié)直腸癌患者Foxp3+Tregs表達(dá)水平有效降低，顯示ω-3PUFAs 可以通過(guò)Foxp3 介導(dǎo)Tregs細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用[12]。本研究中ω-3 PUFAs組與DHA 組Treg細(xì)胞表型比例高于硬脂酸對(duì)照組與空白對(duì)照組，顯示IBD患者體內(nèi)Tregs細(xì)胞減少，而使用ω-3 PUFAs 以及DHA 處理后，Tregs細(xì)胞水平有效改善。正常情況下腸道菌群處于平衡狀態(tài)，這種平衡作用主要由Tregs/Th17細(xì)胞調(diào)節(jié)，炎癥性腸炎發(fā)生時(shí)，Treg細(xì)胞減少，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用紊亂；而ω-3PUFAs 處理后可以從改善細(xì)胞內(nèi)部脂肪酸代謝、細(xì)胞膜磷脂水平、調(diào)節(jié)氧化酶作用以及影響細(xì)胞膜流動(dòng)性等多方面調(diào)節(jié)機(jī)體腸道免疫作用，減輕腸道炎癥[13-14]。

胃腸道Treg細(xì)胞與腸道菌群關(guān)系密切，腸道菌群清除小鼠Tregs細(xì)胞數(shù)量減少，而腸道菌群代謝產(chǎn)物可以有效上調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)量以及IL-10 達(dá)到減輕腸道炎癥目的[15]，進(jìn)一步顯示Treg細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子在腸道免疫功能以及炎癥反應(yīng)過(guò)程中作用重大。本研究中ω-3 PUFAs組、硬脂酸對(duì)照組、DHA 組細(xì)胞內(nèi)部Foxp3、IL-10 mRNA表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組，ω-3 PUFAs組與DHA 組細(xì)胞內(nèi)部Foxp3、IL-10 mRNA表達(dá)水平高于硬脂酸對(duì)照組，顯示添加脂肪酸可以有效調(diào)節(jié)Foxp3、IL-10表達(dá)，而ω-3PUFAs 有效成分EPA 與DHA 對(duì)Foxp3、IL-10表達(dá)調(diào)節(jié)作用更顯著。Foxp3 作為Tregs細(xì)胞特異性標(biāo)志物，其mRNA表達(dá)水平變化顯示了Tregs細(xì)胞功能變化，Tregs細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用主要由其分泌細(xì)胞因子IL-10、IFN-γ 等以及細(xì)胞接觸期間細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原-4 信號(hào)傳遞發(fā)揮作用，IL-10 作為抑制炎癥細(xì)胞因子，在IBD 中具有顯著免疫抑制以及抗炎作用[16-17]。其后分析上清液中炎癥因子水平發(fā)現(xiàn)，脂肪酸尤其是ω-3 PUFAs 與DHA 處理后上清液中細(xì)胞因子IL-10、Foxp3 水平顯著增加，IFN-γ 水平顯著下降，由此本研究推測(cè)，ω-3PUFAs 通過(guò)刺激Foxp3 以及IL-10 水平增加，刺激CD4+CD25-Tregs細(xì)胞向Tregs細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加IL- 10、Foxp3 水平，下調(diào)IFN-γ 水平，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，緩解炎癥。

綜上，ω-3PUFAs 可以通過(guò)激活Tregs細(xì)胞，釋放抑炎細(xì)胞因子，下調(diào)促炎細(xì)胞因子水平達(dá)到糾正IBD 小鼠紊亂免疫應(yīng)激，減輕炎癥作用，其有望為IBD 治療提供新思路。