孫 陽 李 欣 胡超越

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆作為海島棉的主要生產(chǎn)區(qū)，因氣候、環(huán)境、土壤等特點，需要培育抗鹽、抗旱、耐高溫的品種，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良海島棉品種對新疆鹽漬化的適應(yīng)性，是一種快速有效的手段，而這需要組織培養(yǎng)技術(shù)支持，因此海島棉穩(wěn)定再生體系的建立尤為重要[1-2]。目前，棉花組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因的研究棉種主要是陸地棉[3]、克勞茨基棉[4]等。本研究的棉種是海島棉，是目前所報道的可以再生的棉花品種中較難再生的一種，存在胚狀體萌發(fā)率偏低、畸形苗率較高[5]、再生周期長[6]、生根困難[7]、缺少內(nèi)源激素含量水平與最適外源激素濃度之間的關(guān)系探討[8]等問題。

在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)溫度、是否光照等因素對愈傷組織誘導(dǎo)有不同的影響。這些差異會導(dǎo)致外植體生理生化狀態(tài)差異，從而影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生。本研究以3個新疆主栽海島棉品種的下胚軸為外植體，設(shè)置不同溫度、光照條件，分析不同條件對海島棉品種愈傷組織形態(tài)、出愈率等的影響，為建立海島棉高效再生體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆海島棉品種：新海21、新海40、新海44，均由新疆阿拉爾市種子市場購買。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

選取3個新疆海島棉品種在3種光照（全光照、交替光照、全黑暗）、2種溫度（25℃、28℃）條件下誘導(dǎo)愈傷組織形成，重復(fù)3次。觀察比較愈傷組織形成快慢、大小、顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征，并統(tǒng)計出愈率。試驗采用雙因素完全隨機設(shè)計。

1.2.2 測定項目及方法

選取成熟飽滿的海島棉種子，每個品種的海島棉種子各取50粒，在超凈工作臺上用無菌水沖洗1次，75%乙醇溶液消毒30 s，無菌水沖洗1次，用2%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗3次。待種子干燥后接種于裝有1/2 MS培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基上接種4～5粒種子，移入培養(yǎng)室中，置于28℃下全光照培養(yǎng)，以期獲得7 d的無菌苗備用。

選取健康幼苗下胚軸，在超凈工作臺上切成0.8～1 cm大小的段作為外植體，接種于MS（4.74 g/L MS培養(yǎng)基+30 g/L葡萄糖+7.5 g/L瓊脂粉）、輔以激素0.1 mg NAA+0.1 mg KT的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。激素均在滅菌前加入培養(yǎng)基，pH 6.5，121℃高壓滅菌20 min。每個處理接種10～12個外植體，重復(fù)三次。培養(yǎng)溫度為25℃、28℃，光照設(shè)置參考黃莉雅[9]略作調(diào)整，設(shè)置光照培養(yǎng)、光照黑暗交替培養(yǎng)（光照2周+黑暗2周交替處理）、黑暗培養(yǎng)，光照強度1 500～2 000 Lx。

持續(xù)觀察愈傷組織的生長量，愈傷組織的顏色及類型和疏松愈傷組織細胞形態(tài)，并統(tǒng)計25 d出愈率：

愈傷組織出愈率（%）=（形成的愈傷組織數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和DPS（9.01）軟件對愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果進行統(tǒng)計分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對海島棉愈傷組織形態(tài)的影響

本試驗設(shè)置不同溫度、光照條件對3個海島棉品種進行愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果表明：3個海島棉品種愈傷組織顏色以黃綠色、綠色為主，其次為黃色，質(zhì)地多為疏松（圖1，A-F）。在25℃、全光照條件下，新海21愈傷組織顏色則為黃色質(zhì)地疏松（圖1，E）；25℃、交替光照條件下，新海40、新海44愈傷組織顏色多為白色、少數(shù)為綠色，且質(zhì)地多為疏松部分質(zhì)地緊致（圖1，F(xiàn)、I）。在28℃、全光照條件下，新海21愈傷組織為黃綠色質(zhì)地疏松（圖1，D）；28℃、交替光照條件下，新海21、新海40愈傷組織顏色以白色為主、部分為綠色，且質(zhì)地多為疏松（圖1，G、H）。25℃和28℃黑暗條件下進行愈傷組織誘導(dǎo)，新海21誘導(dǎo)出愈傷組織均為白色且質(zhì)地疏松（圖1，N、O），新海40則兩端呈黑色，未出現(xiàn)愈傷組織（圖1，J、K）。通過以上分析，新海21相比新海40和新海44在不同的溫光條件下更容易形成顏色和質(zhì)地較優(yōu)的愈傷組織。

圖1 海島棉愈傷組織顏色、形態(tài)

2.2 不同溫度對愈傷組織形成的影響

在全光照、交替光照條件下，3個海島棉品種在不同溫度條件下愈傷組織形成速度不同，28℃培養(yǎng)溫度出愈時間較早，9天左右即肉眼可見明顯愈傷組織，愈傷組織主要發(fā)生在外植體兩端，顏色多為綠色（圖1，A）。25℃培養(yǎng)溫度出愈時間較晚，11天左右即肉眼可見明顯愈傷組織，顏色多為白、綠色（圖1，B、C）。從愈傷組織形成快慢、形態(tài)等方面觀察，在光照條件一定的情況下，28℃對海島棉愈傷組織生長速度有一定的促進作用，形成的愈傷組織顏色、質(zhì)地更優(yōu)于25℃培養(yǎng)條件。

將相同光照條件下3個海島棉品種在2種溫度下的出愈率進行差異顯著性分析。全光照條件下（圖2，A），新海21、新海40在2種溫度下的出愈率差異顯著；新海44在2種溫度下的出愈率差異未達到顯著水平。交替光照條件下（圖2，B），新海21在2種溫度下的出愈率差異顯著，而新海40、新海44在2種溫度下出愈率差異不顯著。在黑暗條件下（圖2，C），3個海島棉愈傷組織誘導(dǎo)效果較差，只有新海21形成愈傷組織，在28℃和25℃條件下出愈率分別為12.22%、11.94%，新海40、新海44在2種溫度下出愈率均為0。3個海島棉品種2種溫度下的出愈率差異均表現(xiàn)不顯著。

通過以上分析，相比較新海40、新海44，新海21在相同光照條件下誘導(dǎo)愈傷組織對溫度比較敏感，3個海島棉品種在28℃時誘導(dǎo)愈傷組織形成較快、質(zhì)地較好。

圖2 相同光照條件下2種溫度出愈率比較

2.3 不同光照對愈傷組織形成的影響

全光照條件下，海島棉以黃綠色、綠色愈傷組織為主，比交替光照條件下形成的愈傷組織多，且形成快（圖1，A-E）。交替光照條件下出現(xiàn)了白色的愈傷組織，質(zhì)地多為緊致（圖1，F(xiàn)-I），黑暗條件下新海40、44未形成愈傷組織，新海21形成少量愈傷組織，出愈率明顯低于全光照培養(yǎng)和交替光照培養(yǎng)，且差異達到顯著水平。黑暗條件外植體容易誘發(fā)根毛生長，愈傷組織多為白色，外植體兩端呈現(xiàn)黑色（圖1，J-O）。

在溫度一定的情況下，對3個海島棉品種不同光照條件下出愈率進行差異顯著性分析（見圖3）。在溫度為28℃時（圖3，A），3個海島棉品種全光照和交替光照出愈率差異均不顯著，但與黑暗條件下出愈率差異達到顯著水平。溫度為25℃時（圖3，B），新海21在全光照、交替光照、黑暗條件下出愈率間差異均達到顯著水平；新海40交替光照出愈率高于全光照，新海44則相反，但出愈率差異均不顯著，新海40和新海44在全光照、交替光照條件下出愈率與黑暗條件下出愈率差異達到顯著水平。通過以上分析，光照對海島棉愈傷組織形成及形態(tài)、顏色、出愈率等影響較大。本試驗3個海島棉品種出愈率在全光照、交替光照下多數(shù)表現(xiàn)出為差異不顯著；綜合愈傷組織形態(tài)觀察，全光照較交替光照更有利于愈傷組織形成；黑暗條件下愈傷組織形態(tài)較差或未形成愈傷組織，即不利于海島棉愈傷組織的形成。

圖3 相同溫度條件下3種光照出愈率的比較

2.4 不同基因型對愈傷組織形成的影響

3個品種海島棉形成以黃色、黃綠色、綠色為主，質(zhì)地多為疏松的優(yōu)質(zhì)愈傷組織（圖1，A-E）。在相同溫度、光照條件下，新海21愈傷組織以黃色、質(zhì)地疏松為主，生長速度較快，愈傷組織成塊較大；新海40和新海44愈傷組織以綠色、質(zhì)地緊致為主，生長速度較慢，愈傷組織成塊較?。▓D1）。

在全光照和交替光照條件下，3個海島棉品種（基因型）在2種溫度下均可以形成愈傷組織，但出愈率不同，黑暗條件下，只有新海21形成少量愈傷組織（圖4）。在光照和溫度一致的條件下，對3個品種（基因型）的海島棉出愈率進行差異顯著性分析。在28℃（圖4，A）時，全光照條件下，新海21出愈率低于新海40、新海44的出愈率且差異顯著；交替光照條件下，3個品種的出愈率差異不顯著；黑暗條件下，新海40、新海44的出愈率為0，且與新海21的出愈率差異達到顯著水平。在25℃（圖4，B）時，全光照條件下，新海40的出愈率低于新海21、新海44的出愈率且差異顯著；交替光照條件下，新海21出愈率低于新海40、新海44的出愈率且差異顯著；黑暗條件下，新海40、新海44出愈率為0且與新海21的出愈率差異達到顯著水平。通過以上分析，3個海島棉品種在相同條件下誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)、出愈率表現(xiàn)不同。新海21出愈率與新海40、新海44出愈率差異大部分達到顯著水平，而新海40和新海44出愈率差異大部分表現(xiàn)不顯著。說明基因型對海島棉愈傷組織形態(tài)、愈傷組織誘導(dǎo)快慢、出愈率等均有一定的影響。

圖4 相同溫度、光照條件下3個品種出愈率的比較

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中，光溫條件是影響生長發(fā)育的關(guān)鍵因子，不同的培養(yǎng)條件對海島棉愈傷組織發(fā)生及形態(tài)的影響有較大差異。本研究以海島棉新海21、40、44下胚軸為外植體材料，愈傷組織誘導(dǎo)階段在培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT時，出愈率可達90.26%～97.31%，愈傷組織顏色以黃綠色、綠色為主，質(zhì)地多為疏松，黑暗條件下新海40、新海44未形成愈傷組織。3個品種愈傷組織培養(yǎng)可能更適應(yīng)溫度為28℃、全光照的培養(yǎng)條件。

（1）李占岐等[10]人研究表明“湘棉-18”莖尖培養(yǎng)時，最適培養(yǎng)溫度為26℃～29℃，低于24℃愈傷組織生長緩慢，不利于植株生長發(fā)育。顧冉冉等[11]、師海榮等[12]研究結(jié)果為新陸早33及百棉1號愈傷組織誘導(dǎo)溫度均為（28±1）℃。本試驗結(jié)果表明28℃相比于25℃更有利于海島棉新海21、40、44形成愈傷組織，這與以上研究結(jié)果基本一致。

（2）光照能夠誘導(dǎo)植物組織形態(tài)的建成，影響離體培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化，對外植體細胞最初分裂的影響更為顯著[13]。本研究結(jié)果顯示，在暗培養(yǎng)條件下海島棉愈傷組織誘導(dǎo)階段出愈率明顯低于光照培養(yǎng)和交替培養(yǎng)，這與劉艷等[14]人研究紫蘇愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果基本一致。李占岐等[10]人研究表明，暗培養(yǎng)的“湘棉-18”外植體比光照下的易形成愈傷和胚狀體，而且光照對生根的影響較大。而本研究中黑暗條件對海島棉新海21、40、44的愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因有待進一步研究，但本實驗中海島棉黑暗條件外植體容易誘發(fā)根毛生長這與李占岐等人研究結(jié)果相似。本試驗結(jié)果顯示交替培養(yǎng)雖然出愈率與全光照培養(yǎng)相差不大，但是誘導(dǎo)效果不及全光照培養(yǎng)，顏色質(zhì)地差異較大，可能是光照對海島棉愈傷組織某些酶活性和葉綠體代謝產(chǎn)物存在一定影響，從而影響愈傷組織色素合成。前人研究發(fā)現(xiàn)，新陸早33、45、50及柯字棉312先暗處理后光處理更有利于棉花下胚軸愈傷組織發(fā)生[15-16]。這可能是不同的植物組織生長、發(fā)育受光照的調(diào)節(jié)機制不同所致[17]。本研究未對先黑暗后光照、一天內(nèi)光照交替條件下愈傷組織誘導(dǎo)效果進行研究，并且光處理時光強、光質(zhì)、光周期對海島棉愈傷組織形成的影響，也有待進一步探討。

（3）在不同溫度、光照條件下誘導(dǎo)的海島棉愈傷組織表現(xiàn)不同，除了溫度、光照對愈傷組織形態(tài)、愈傷組織形成快慢、出愈率有著不同程度的影響，還可能存在基因型與之互作，本試驗的3個海島棉品種（基因型）數(shù)量少，不同基因型與溫度、光照對愈傷組織形成的影響是否存在互作、互作大小等，還需要對更多不同基因型海島棉進行深入地研究。