康曉明,楊舒賀,聶 晶,孟慶云,楊 松,楊占雙(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科， 黑龍江 佳木斯 154003)

腎臟纖維化是慢性腎臟疾病終末期過程,其改變包括炎性細胞浸潤，成纖維細胞活化，管周毛細血管損失和腎小管萎縮[1]。Yuan[2]等證明，腎近端小管上皮細胞的線粒體代謝功能障礙參與了上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)病機制。線粒體功能的異常激活凋亡程序是纖維化的重要細胞因子條件。Corcoran[3]等人證明線粒體在腎上皮細胞中具有擴增TGF-β1誘導(dǎo)纖維化，表明線粒體通過調(diào)節(jié)TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進纖維化的進展。目前，纖維化的具體作用機制及相關(guān)通路的探索仍缺乏全面認識及更詳盡的敘述，故本課題意在探討該通路的因子調(diào)節(jié)程序，為研發(fā)抗腎間質(zhì)纖維化的藥物、慢性腎臟疾病的控制及治療具有重要臨床應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性Wistar大鼠體重(150±10)g；吡菲尼酮片，兔抗大鼠TGF-β1、smad3多克隆抗體、DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實驗步驟

72只Wistar雄性大鼠體重隨機均分為3組,行單側(cè)輸尿管結(jié)扎制成UUO模型，分為假手術(shù)組、模型組、吡菲尼酮(500mg/kg·d灌胃),模型組和對照組以等量生理鹽水灌胃；各組大鼠灌胃每日一次。各組大鼠分別在手術(shù)后第3, 7, 14天分批處死。處死前留取靜脈血，留取左側(cè)梗阻腎標本，梗阻腎沿矢狀面用手術(shù)剪小心剖開，腎組織在4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)脫水石蠟包埋，待做HE染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)等。

1.2.2 生化指標檢測

各組大鼠靜脈血行血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)生化檢測。

1.2.3 HE

各組腎組織經(jīng)切片染色后光鏡下選取10個200倍不同視野，用TLS評分表示損傷程度[4]。

1.2.4 免疫組化

觀察TGF-β1、smad3表達狀況，視野內(nèi)表現(xiàn)為棕黃色的顆粒為染色陽性指標。隨機觀察10個不同視野，利用圖像分析系統(tǒng)分析兩組陽性染色(棕黃色顆粒)的平均光密度，用AOD表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 生化分析

Sham 組鼠血BUN、Scr等生化指標無明顯差異(P>0.05)。UUO模型組大鼠生化指標較sham 組明顯升高，治療組大鼠指標較UUO組各指標降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組生化指標變化

2.2 HE 染色

光鏡下可見Sham組大鼠在第3、7、14d腎臟結(jié)構(gòu)無明顯改變。UUO模型組大鼠隨著時間的增加，腎小管擴張，間質(zhì)可見炎性細胞浸潤，基底膜細胞被大量破壞。治療組基底膜細胞破壞程度及炎性物質(zhì)浸潤程度均較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠不同時間點TIS評分比較分)

2.3 免疫組化

Sham 組TGF-β1及smad3表達較少；UU0組隨梗阻時間的延長表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與UUO組相比，治療組 棕色顆粒表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。見表3。

表3 3組大鼠TGF-β1、Smad 3在腎小管表達情況

3 討論

吡菲尼酮(5-甲基-1-苯基-2(1H) - 吡啶酮)已被臨床用于治療各種纖維化疾病[5]。Takakuta[6]等發(fā)現(xiàn)它可抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維連接蛋白的表達。 通過干預(yù)體外實驗中大鼠腎臟成纖維細胞，減弱活化和有絲分裂，導(dǎo)致纖維連接蛋白明顯減少?？杀Ａ羰軗p腎臟細胞中線粒體嵴結(jié)構(gòu)，減少了腫脹線粒體的出現(xiàn)，起到保護腎臟功能的作用，并且其對線粒體的調(diào)節(jié)機制是通過誘導(dǎo)TGF-β/smads通路實現(xiàn)的[7]。在肝纖維化動物模型中，還可降低TGF-β1 mR N A表達，膠原特異性分子被認為在細胞外基質(zhì)合成和重塑中起重要作用。在腎臟研究中，吡菲尼酮已被證明可通過降低纖溶酶原激活物抑制劑-1表達，誘導(dǎo)TGF-β1對于基質(zhì)的降解作用與本實驗觀察結(jié)果一致。在小鼠系膜細胞中，吡菲尼酮降低TGF-β1啟動子活性，降低蛋白分泌，并調(diào)節(jié)下游Smad通路磷酸化[8]，與本實驗研究結(jié)果一致。

TGF-β1可通過激活Smad依賴性和非依賴性途徑誘導(dǎo)肌成纖維細胞分化來增強成纖維細胞的增殖，遷移和膠原產(chǎn)生能力，導(dǎo)致纖維化的出現(xiàn)。Monique[9]等實驗證實吡菲尼酮治療減弱TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2 / 3的磷酸化，與本實驗研究發(fā)現(xiàn)治療組大鼠較UUO組相比TGF-β1及smad3表達較對應(yīng)時間點減少，結(jié)果一致。

結(jié)合本實驗結(jié)果，證實了TGF-β1/smad3通路在腎間質(zhì)纖維化進展過程中起到重要的作用。其可通過抑制線粒體形態(tài)及功能，進而影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化進程及降解細胞外基質(zhì)等多種途徑影響纖維化。吡菲尼酮可抑制腎小管內(nèi)TGF-β1/smad3通路的表達從而延緩腎纖維化的進程。