向 穎, 董婉未, 蔣國芳,,*, 洪 芳, 張佑祥, 張文武

(1. 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南吉首 416000; 2. 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院, 福建泉州 362000;3. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點實驗室, 南京 210023;4. 湖南烏云界國家級自然保護(hù)區(qū)管理局, 湖南常德 415700)

種群是生物進(jìn)化的基本單位，種群遺傳分化研究是生物遺傳多樣性與物種進(jìn)化的核心問題之一(Frankhametal., 2004)。探討珍稀保護(hù)生物的種群遺傳多樣性和分化、種群歷史動態(tài)等，不僅可以幫助我們理解種群形成及其演化過程，外界因素對該種群遺傳特性的影響以及種群的生態(tài)適應(yīng)性(Slatkin, 1987)，還可以為擴(kuò)大其種群數(shù)量及相關(guān)保護(hù)策略的制定提供理論依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和相關(guān)技術(shù)的實踐應(yīng)用，種群分化研究所應(yīng)用的分子標(biāo)記也越來越多，如線粒體、核糖體和微衛(wèi)星等(Sei and Porter, 2007; Kodandaramaiahetal., 2012)。mtDNA已成為譜系地理學(xué)研究中最常用的分子標(biāo)記(張代臻等, 2008)，而核基因則能夠補(bǔ)充mtDNA不具備的信息。所以，將兩類不同進(jìn)化速率和遺傳方式的分子標(biāo)記(線粒體基因和核基因)相結(jié)合進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果將更加全面可靠。近年來，已有學(xué)者利用這兩類分子標(biāo)記對蝴蝶種群遺傳多樣性(Bulletal., 2006)、種群遺傳結(jié)構(gòu)(Czajkowskaetal., 2020)、種群歷史動態(tài)(Flanaganetal., 2004)和生物地理格局及其形成歷史(Dinc?etal., 2011)等進(jìn)行了深入探討。

中華虎鳳蝶Luehdorfiachinensis隸屬鱗翅目(Lepidoptera)鳳蝶科(Papilionidae)虎鳳蝶屬Luehdorfia。該蝶僅分布于我國秦嶺和長江中下游部分地區(qū)(董思雨等, 2014)，是中國特有的蝴蝶，屬國家二級保護(hù)野生動物，極具生態(tài)保護(hù)與觀賞價值。目前關(guān)于中華虎鳳蝶的分布范圍(何桂強(qiáng)等, 2011; 李密等, 2012)、生物學(xué)特性(童雪松和潛祖琪, 1992; 王文明等, 2010)、保護(hù)現(xiàn)狀(袁德成等, 1998)和食性研究(姚洪渭等, 1999; 姚肖永等, 2008)等方面均有報道，但中華虎鳳蝶種群遺傳分化研究的相關(guān)報道缺乏。本研究首次采用4個分子遺傳標(biāo)記，即線粒體COI基因和3個非編碼核基因(ITS2,Pgi-intron和Tpi-intron)片段，研究我國5個地區(qū)(江蘇、浙江、安徽、江西和湖南)的中華虎鳳蝶指名亞種L.chinensischinensis地理種群間的遺傳分化，以期為中華虎鳳蝶的種群保護(hù)提供重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究所用中華虎鳳蝶指名亞種60頭幼蟲樣本于2013-2014年間分別采集自江西、浙江、安徽、江蘇和湖南5個地區(qū)。收集到的樣本均浸泡在無水乙醇中保存?zhèn)溆?。詳?xì)信息見表1。

表1 中華虎鳳蝶指名亞種樣本采集信息

1.2 PCR擴(kuò)增及測序

使用Progema試劑盒分別提取中華虎鳳蝶指名亞種各地理種群各頭幼蟲樣本的總DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，保存于-20℃冰箱中備用。本研究選取了線粒體基因COI以及非編碼核基因ITS2,Pgi-intron和Tpi-intron作為目的基因。線粒體基因COI的引物是依據(jù)中華虎鳳蝶線粒體全基因組序列(Liuetal., 2013)設(shè)計；而核基因引物是根據(jù)EPIC(exon-primed-intron-crossing)方法(Jennings and Etter, 2011)設(shè)計。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物的詳細(xì)信息見表2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL， 10×PCR Buffer 2.5 μL， MgCl2(20 μmol/L) 2 μL， dNTPs (10 μmol /L) 2 μL， Taq 酶(2 U/μL) 0.2 μL， ddH2O 16.3 μL。PCR擴(kuò)增程序： 95℃預(yù)變性5 min； 95℃變性30 s， 55℃(核基因)或51℃(COI)退火30 s， 35個循環(huán)； 72℃延伸1 min(核基因)或30 s(COI)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸補(bǔ)齊10 min， 4℃保溫。所有PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表2 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DNASTAR (Burland, 2000)和MEGA 7.0 (Kumaretal., 2016)對擴(kuò)增基因進(jìn)行校正比對，分析序列堿基組成及序列變異情況。使用SequenceMatrix軟件將4個分子標(biāo)記串聯(lián)后進(jìn)行以下分析：使用DnaSP 5.10.1 (Librado and Rozas, 2009)計算所有采集到的5個種群的多態(tài)性位點數(shù)(S)、核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(K)。使用軟件Arlequin v3.5.1.3 (Excoffier and Lischer, 2010)進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)和遺傳變異分析，計算各地理種群的Tajima’sD值(Tajima, 1989)、Fu’sFs值(Fu, 1997)、基因流(Nm)及群體間的分化指數(shù)(Fst)。群體間Fst系數(shù)和基因流(Nm)分別是衡量種群間遺傳分化程度和基因交流程度大小的指數(shù)(Hudsonetal., 1992; Rousset, 1997)，F(xiàn)st>0.25和Nm<1，則種群遺傳分化大，基因流小。

為檢驗種群間的遺傳分化與種群間的地理距離是否具有相關(guān)性，在MEGA 7.0中利用Kimura 2-Parameter (K2P)模型分別計算地理種群的遺傳距離。根據(jù)經(jīng)緯度計算各采樣地點的地理距離及其自然對數(shù)，利用PC-ORD 5軟件(Grandin, 2006)對遺傳距離及地理距離的自然對數(shù)進(jìn)行Mantel檢驗，分析地理種群間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 堿基組成及序列變異

對5個中華虎鳳蝶指名亞種地理種群共60頭供試樣本分別進(jìn)行了COI和ITS2,Pgi-intron和Tpi-intron4個基因片段擴(kuò)增測序，每個基因片段各獲得了60條序列。各基因片段的GenBank登錄號見表1，序列特征和變異信息見表3。COI基因的變異位點和簡約信息位點最少，A, G, C和T平均含量分別為30.62%, 13.72%, 14.74%和40.92%，符合昆蟲線粒體基因序列組成(Liu and Beckenbach, 1992)。使用3對核基因序列擴(kuò)增引物對中華虎鳳蝶指名亞種樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的基因序列長度分別為760 bp (ITS2), 1 122 bp (Pgi-intron)和757 bp (Tpi-intron)，Tpi-intron變異位點和簡約信息位點最多，其次是Pgi-intron和ITS2。4個基因序列串聯(lián)后的基因序列(以下簡稱“合并序列”)全長為3 277 bp，A+T%(66.6%)>G+C%(33.4%)，和COI基因一樣，有較強(qiáng)的AT偏好性。

表3 中華虎鳳蝶指名亞種地理種群線粒體基因和核基因序列的堿基組成及變異

2.2 遺傳多樣性

基于合并序列對中華虎鳳蝶指名亞種5個地理種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表4?？?cè)后w核苷酸多樣性(π)為0.00686，平均核苷酸差異數(shù)(K)為18.289。各地理種群內(nèi)核苷酸多樣性(π)為0.00121～0.01138，多態(tài)性位點數(shù)(S)為7～92，其中寶華山種群(BHS)的π和S均為最小，而桃紅嶺種群(THL)的均為最大。

表4 基于線粒體基因和核基因合并序列的中華虎鳳蝶指名亞種地理種群的遺傳多樣性和中性檢驗

2.3 遺傳分化

基于合并序列的種群間分化指數(shù)和基因流如表5所示，總?cè)后wFst為0.4910，Nm為0.2600，說明地理種群間的遺傳分化程度較大。寶華山種群(BHS)和烏云界種群(WYJ)Fst最大(0.7819)，Nm最小(0.1394)，兩地理種群間分化程度高，基因交流不頻繁；而寶華山種群(BHS)和滁州種群(CZ)Fst最小(0.0812)，Nm最大(5.6582)，說明它們基因交流程度高，遺傳分化較小。對中華虎鳳蝶指名亞種地理種群進(jìn)行AMOVA分析(表6)，結(jié)果表明中華虎鳳蝶指明亞種的變異主要是來自于種群內(nèi)部(52.79%)，群體間的遺傳變異略小。

表5 基于線粒體基因和核基因合并序列的中華虎鳳蝶指名亞種地理種群的配對種群間分化指數(shù)(Fst)(下三角)和基因流(Nm)(上三角)

依據(jù)Kimura 2-Parameter雙參數(shù)模型，基于合并序列計算中華虎鳳蝶指名亞種地理種群間的遺傳距離(表7)。各地理種群的遺傳距離在0.0019～0.0105之間，遺傳距離最大的是杭州種群(HZ)和桃紅嶺種群(THL)(0.0105)，最小的為滁州種群(CZ)和寶華山種群(BHS) (0.0019)。就地理距離來講，相距最近的是滁州種群(CZ)和寶華山種群(BHS)，相距最遠(yuǎn)的為烏云界種群(WYJ)和杭州種群(HZ)。對地理種群間的地理距離的對數(shù)值和遺傳距離進(jìn)行Mantel相關(guān)性檢驗，結(jié)果顯示R=0.8519,P=0.018<0.05，表明中華虎鳳蝶指名亞種各地理種群間的地理距離和遺傳距離呈正相關(guān)關(guān)系。

表6 基于線粒體基因和核基因合并序列的中華虎鳳蝶指名亞種地理種群的分子方差分析(AMOVA)

表7 基于線粒體基因和核基因合并序列的中華虎鳳蝶指名亞種地理種群間的成對遺傳距離(下三角)與地理距離(km)自然對數(shù)值(上三角)

2.4 種群歷史動態(tài)

基于合并序列對中華虎鳳蝶指名亞種地理種群中性檢驗和錯配分布進(jìn)行分析(圖1和表4)，總種群的Tajima’sD和Fu’sFs分別為2.52028和-0.32628，但不顯著，而且總種群的錯配分布圖呈現(xiàn)多峰分布。對各種群來講，Tajima’sD和Fu’sFs均為正值，這表明近期各種群都沒有出現(xiàn)擴(kuò)張。

3 討論

核苷酸多樣性(π)是評價物種遺傳多樣性的重要參數(shù)(Grant and Bowen, 1998)，基因聯(lián)合片段序列π>0.005，表明中華虎鳳蝶指名亞種總種群遺傳多樣性較高。合并基因序列的AMOVA分析結(jié)果表明遺傳分化主要來自種群內(nèi)部，呼曉慶和楊兆富(2019)對中國草地螟Loxostegesticticalis地理種群的遺傳分析中也得出了類似結(jié)果。

圖1 基于線粒體基因和核基因合并序列的中華虎鳳蝶指名亞種地理種群的錯配分布

有研究表明，對植食性昆蟲而言，地理隔離和寄主植物分化是使不同種群產(chǎn)生遺傳分化重要原因(Forbesetal., 2017; 朱詩禹等, 2017; Goodmanetal., 2019)。中華虎鳳蝶指名亞種總種群Fst>0.4,Nm<1，表明種群間的遺傳分化大，基因交流少。Mantel檢驗結(jié)果表明遺傳距離與地理距離呈現(xiàn)正相關(guān)性，而許多其他研究也得出類似結(jié)論(薛進(jìn)等, 2007; 謝艷蘭等, 2019)。值得注意的是WYJ種群和BHS, CZ及HZ種群的遺傳分化非常大(Fst>0.65,Nm<1)，我們認(rèn)為這不僅僅和地理隔離有關(guān)，寄主植物的分化也產(chǎn)生了重要影響；BHS, CZ及HZ種群屬于低海拔類群，寄主植物為杜蘅Asarumforbesii(袁德成等, 1998; 王文明等, 2010)，而WYJ種群是高海拔種群，寄主植物為細(xì)辛A.sieboldii(譚濟(jì)才等, 2010)，中華虎鳳蝶不同地理種群對不同寄主植物產(chǎn)生了適應(yīng)性進(jìn)化。

Tajima’sD和Fu’sFs檢驗是可反映出種群變化動態(tài)歷史的中性檢驗方法。Fu’sFs和Tajima’sD檢驗值<0時，則表明種群有擴(kuò)張及瓶頸效應(yīng)，反之則種群穩(wěn)定(Harpendingetal., 1998; Ramos-Onsins and Rozas, 2002)。中華虎鳳蝶指名亞種各種群Tajima’sD值均大于0，F(xiàn)u’sFs值不顯著，由此推測，中華虎鳳蝶指名亞種在歷史上并沒有發(fā)生種群擴(kuò)張。錯配分布是以可視化方式體現(xiàn)群體歷史動態(tài)，當(dāng)種群形成歷史較短或發(fā)生擴(kuò)張時，其錯配分布曲線呈現(xiàn)單峰；而當(dāng)種群為存在時間較長且穩(wěn)定的種群時，錯配分布曲線則呈現(xiàn)多峰曲線分布(Excoffier and Lischer, 2010; 蘇軍虎等, 2017)。中華虎鳳蝶指名亞種總種群錯配分布圖呈現(xiàn)多峰分布，其種群在歷史上較穩(wěn)定。綜上，中華虎鳳蝶指名亞種各地理種群較穩(wěn)定，近期沒有經(jīng)歷明顯的種群擴(kuò)張。

本研究采用4個分子標(biāo)記對中華虎鳳蝶指名亞種5個地理種群進(jìn)行研究，結(jié)果顯示各地理種群遺傳多樣性較高，遺傳變異較豐富，物種的環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，較容易在新的環(huán)境中生存，表明近年來中華虎鳳蝶的保護(hù)工作是有一定成效的。但值得注意的是，中華虎鳳蝶種群分布格局具有密度低、種群間隔大的特征(袁德成等, 1998; 董思雨等, 2014)。因此，在后續(xù)的保護(hù)工作中不能掉以輕心，應(yīng)繼續(xù)保護(hù)好其棲息地和寄主植物資源，嚴(yán)禁采挖；對于種群數(shù)量小的野外種群也可以輸入人工繁育個體保證其有效種群大小。

致謝本研究所用部分蝴蝶幼蟲由江西中醫(yī)學(xué)院賈鳳海教授、滁州學(xué)院褚立新教授和浙江杭州樓信權(quán)先生提供，在此深表謝意！