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        基于蜜蜂球囊菌納米孔測序數(shù)據(jù)的基因非翻譯區(qū)延長、SSR位點發(fā)掘及未注釋基因和轉(zhuǎn)錄本鑒定

        2021-01-12 11:38:22付中民祝智威馮睿蓉王秀娜蔣海賓范元嬋范小雪熊翠玲鄭燕珍徐國鈞陳大福
        昆蟲學(xué)報 2020年11期
        關(guān)鍵詞:數(shù)據(jù)庫功能

        杜 宇, 付中民, 祝智威, 王 杰, 馮睿蓉, 王秀娜, 蔣海賓,范元嬋, 范小雪, 熊翠玲, 鄭燕珍, 徐國鈞, 陳大福, 郭 睿,*

        (1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350002;3. 福建農(nóng)林大學(xué), 福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室, 福州 350002)

        蜜蜂是自然界最重要的授粉昆蟲,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)維持方面發(fā)揮不可替代的作用(Montoya-Pfeifferetal., 2020)。此外,蜜蜂生產(chǎn)的蜂王漿、蜂蜜、蜂膠和蜂蠟等蜂產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價值(Ahmadetal., 2020)。但作為群居性昆蟲,蜜蜂易遭受細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物的侵襲而罹患疾病。其中,蜜蜂白堊病是一種長期困擾養(yǎng)蜂生產(chǎn)的頑疾,由蜜蜂球囊菌Ascopshaeraapis侵染蜜蜂幼蟲而引發(fā)(Jensenetal., 2013)。到目前為止,養(yǎng)蜂生產(chǎn)中對于白堊病仍缺乏有效的防治手段(陳大福等, 2017)。

        Qin等(2006)通過對蜜蜂球囊菌0.5-1 A和A10菌株進(jìn)行Sanger測序,組裝了蜜蜂球囊菌的基因組草圖,但作者當(dāng)時僅公布了基因序列信息,并沒有同時公布基因功能注釋信息,導(dǎo)致該版本的基因組長期無法被有效利用,阻礙了蜜蜂球囊菌的進(jìn)一步研究。Shang等(2016)運(yùn)用二代測序技術(shù)對蜜蜂球囊菌ARSEF 7405菌株進(jìn)行測序,重新組裝和注釋了scafford水平的蜜蜂球囊菌參考基因組(AAP 1.0),同時公布了完整的基因序列和基因功能注釋信息,為該真菌病原的組學(xué)和分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。由于測序技術(shù)的限制,除人類(Audanoetal., 2019)、小鼠Musmusculus(Mouse Genome Sequencing Consortium, 2009)和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Solaresetal., 2018)等極少數(shù)模式生物的基因組組裝到染色體水平外,多數(shù)物種的基因組僅組裝到contig或scafford水平,仍有較大的提升空間。近年來,以牛津納米孔(Oxford Nanopore)長讀段測序技術(shù)和PacBio單分子實時(single-molecule real-time, SMRT)測序技術(shù)為代表的三代測序技術(shù)逐漸興起并快速發(fā)展。三代測序技術(shù)因具有超長讀長的顯著優(yōu)勢而能夠輕松跨越重復(fù)序列,目前已成為基因組研究的利器(Luetal., 2016; Nakanoetal., 2017)。人們已利用純?nèi)鷾y序或三代測序結(jié)合二代測序?qū)⑷祟?Pendletonetal., 2015)、跳鐮猛蟻Harpegnathossaltator(Shieldsetal., 2018)和蘋果Malusdomestica(Daccordetal., 2017)等物種的基因組組裝到染色體水平。但目前基于三代測序技術(shù)的基因組測序成本較高,對一些基因組較大的物種進(jìn)行基因組測序成本仍然高昂;對于一些經(jīng)費(fèi)有限的實驗室,利用三代測序技術(shù)進(jìn)行基因組測序還存在較大困難。與基于三代測序技術(shù)的基因組測序相比,通過三代測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序的周期較短且成本較低(Magrinietal., 2018),因此利用三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對現(xiàn)有的參考基因組注釋進(jìn)行完善是可行性較高的替代策略。近期,利用PacBio SMRT測序得到的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對錫蘭勾蟲Ancylostomaceylanicum(Magrinietal., 2018)和小麥Triticumaestivum(Dongetal., 2015)基因組注釋進(jìn)行完善的研究已見諸報道。然而,利用基于Nanopore測序得到的長讀段數(shù)據(jù)對基因組注釋進(jìn)行完善的研究報道匱乏。

        為開展蜜蜂球囊菌的全長轉(zhuǎn)錄組研究,筆者前期已利用Nanopore長讀段測序技術(shù)對蜜蜂球囊菌的純化菌絲(AaM)和純化孢子(AaS)分別進(jìn)行測序,基于高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)構(gòu)建和注釋了蜜蜂球囊菌的首個全長轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表數(shù)據(jù));并對蜜蜂球囊菌基因的可變剪切和可變腺苷酸化進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定和分析(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究利用已獲得的高質(zhì)量Nanopore長讀段測序?qū)ΜF(xiàn)有的蜜蜂球囊菌參考基因組中已注釋基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,對未注釋的簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)位點進(jìn)行鑒定,進(jìn)而對未注釋的新基因和新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行鑒定和功能注釋,并預(yù)測完整開放閱讀框(open reading frame, ORF)。研究結(jié)果可為蜜蜂球囊菌參考基因組的序列和功能注釋提供重要補(bǔ)充,也能為其他物種的基因組完善提供思路和方法借鑒。

        1 材料與方法

        1.1 長讀段測序數(shù)據(jù)來源

        前期已通過Oxford Nanopore技術(shù)對來源于純培養(yǎng)的蜜蜂球囊菌AaM和AaS分別進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了高質(zhì)量的長讀段測序數(shù)據(jù),分別測得6 321 704和6 259 727條原始讀段(raw reads),居中長度(N50)分別為1 094和1 157 bp,平均讀長分別為992和1 047 bp,最大讀長分別為9 421和13 060 bp;分別鑒定出9 859和16 795條非冗余全長轉(zhuǎn)錄本,N50分別達(dá)1 482和1 658 bp,平均長度分別為1 187和1 303 bp,最大長度分別為6 472和6 815 bp (未發(fā)表數(shù)據(jù))。納米孔測序原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫,獲得BioProject號: PRJNA645872。

        1.2 基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化

        由于軟件和數(shù)據(jù)本身的局限性,導(dǎo)致多數(shù)基因組的基因結(jié)構(gòu)信息不夠精確,需要進(jìn)一步優(yōu)化。為最大限度對蜜蜂球囊菌的參考基因組注釋進(jìn)行完善,本研究將AaM和AaS的長讀段測序數(shù)據(jù)混合后采用gffcompare軟件(http:∥ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml)將鑒定到蜜蜂球囊菌的全長轉(zhuǎn)錄本與蜜蜂球囊菌參考基因組(AAP 1.0)注釋的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較,然后對基因組注釋的基因結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行優(yōu)化。若在注釋基因邊界之外的區(qū)域有比對上的讀段(mapped reads)支持,則將注釋基因的非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)向上游或下游延伸以修正注釋基因的邊界。

        1.3 完整ORF的生物信息學(xué)預(yù)測

        利用TransDecoder軟件(http:∥transdecoder.sourceforge.net/)基于ORF長度、對數(shù)似然函數(shù)值、氨基酸序列及Pfam數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域序列的比對等信息,從蜜蜂球囊菌AaM和AaS的長讀段測序混合數(shù)據(jù)鑒定到的新轉(zhuǎn)錄本序列中識別可靠的潛在編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)及其對應(yīng)氨基酸序列,同時預(yù)測包含起始密碼子和終止密碼子的完整ORF。

        1.4 SSR位點的鑒定及分析

        MISA軟件(http: ∥pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)可以通過分析轉(zhuǎn)錄本序列鑒定出8種類型的SSR,包括單核苷酸重復(fù)(p1)、雙核苷酸重復(fù)(p2)、三核苷酸重復(fù)(p3)、四核苷酸重復(fù)(p4)、五核苷酸重復(fù)(p5)、六核苷酸重復(fù)(p6)、混合SSR(c和c*)(即兩個SSR之間的距離小于100 bp),其中c類型的SSR重復(fù)序列之間包含若干個堿基,而c*類型的SSR重復(fù)序列之間沒有或只有一個其他堿基(Thieletal., 2003)。從去冗余的蜜蜂球囊菌全長轉(zhuǎn)錄本中篩選長度在500 bp以上的全長轉(zhuǎn)錄本,利用MISA軟件預(yù)測SSR位點,采用默認(rèn)參數(shù)。

        1.5 新基因和新轉(zhuǎn)錄本的鑒定及功能注釋

        通過將蜜蜂球囊菌的全長轉(zhuǎn)錄本與參考基因組注釋的基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較,鑒定現(xiàn)有參考基因組上未注釋的新基因和新轉(zhuǎn)錄本。利用Blast工具將上述新基因和新轉(zhuǎn)錄本分別比對Nr, Swiss-Prot, Pfam, KOG, eggNOG, GO和KEGG數(shù)據(jù)庫以獲得相應(yīng)的功能注釋。

        2 結(jié)果

        2.1 蜜蜂球囊菌參考基因組已注釋基因的5′UTR和3′UTR延長

        共對蜜蜂球囊菌的9 481個基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,其中5′UTR和3′UTR延長的基因分別有4 744和4 737個。部分蜜蜂球囊菌基因的結(jié)構(gòu)優(yōu)化信息如表1所示。

        表1 蜜蜂球囊菌參考基因組已注釋的10個基因的結(jié)構(gòu)優(yōu)化信息概要

        2.2 蜜蜂球囊菌基因組中完整ORF預(yù)測

        共預(yù)測出10 492個完整ORF,它們編碼的氨基酸序列長度分布介于0~400 aa,其中分布在0~100 aa的ORF數(shù)量最多,為4 088個(占38.96%);其次為分布在100~200, 200~300和300~400 aa的ORF,數(shù)量分別為3 872個(占36.90%), 1 525個(占14.53%)和595個(占5.67%)(圖1)。

        2.3 蜜蜂球囊菌參考基因組未注釋SSR位點

        本研究在24 294 167 bp的序列中共鑒定到5 286個SSR位點,含有SSR位點超過1個的基因數(shù)為1 004個,混合SSR位點有434個。此外,p1, p2, p3, p4, p5和p6的數(shù)量分別為1 870, 826, 2 398, 138, 43和11個(表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),p3類型的SSR密度最大,達(dá)到83.72個/Mb,其次為p1, p2, c, p4, p5, c*和p6,分別達(dá)到65.20, 27.91, 15.77, 4.86, 1.48, 0.45和0.33個/Mb(圖2)。

        表2 蜜蜂球囊菌參考基因組中SSR位點的MISA軟件分析結(jié)果

        2.4 蜜蜂球囊菌參考基因組中未注釋的新基因的鑒定及功能注釋

        圖2 蜜蜂球囊菌參考基因組中不同類型SSR的密度統(tǒng)計

        共鑒定到1 558個新基因,其中分別有1 556, 731, 330, 592, 1 177, 709和589個新基因可分別被注釋到Nr, Swiss-Prot, Pfam, KOG, eggNOG, GO和KEGG數(shù)據(jù)庫。Nr數(shù)據(jù)庫中新基因注釋數(shù)量最多的物種是蜜蜂球囊菌,其次為Polytolypahystricis和伊蒙微小菌Emmonsiaparva(圖3: A)。新基因可注釋到KOG數(shù)據(jù)庫的25個功能類別,注釋數(shù)量最多的是僅一般功能預(yù)測(general function prediction only),其次是翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶(posttranslational modification, protein turnover, chaperones),氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(amino acid transport and metabolism),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanisms)以及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成(translation, ribosomal structure and biogenesis)等(圖3: B)。此外,新基因可被注釋到eggNOG數(shù)據(jù)庫的25個功能類別,數(shù)量最多的為未知功能(function unknown),其次為碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(carbohydrate transport and metabolism),翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶,細(xì)胞內(nèi)移動、分泌和囊泡運(yùn)輸(intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport),轉(zhuǎn)錄(transcription)以及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成等(圖3: C)。

        圖3 蜜蜂球囊菌參考基因組中新基因的Nr(A)、KOG(B)和eggNOG(C)數(shù)據(jù)庫注釋

        蜜蜂球囊菌的新基因還能被注釋到GO數(shù)據(jù)庫的37個功能條目,包括細(xì)胞組件(cell part)(347個),細(xì)胞(cell)(340個),細(xì)胞器(organelle)(262個)等細(xì)胞組分相關(guān)GO term;催化活性(catalytic activity)(328個),結(jié)合(binding)(254個)等分子功能相關(guān)GO term;細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)(359個),代謝進(jìn)程(metabolism process)(340個),單一組織進(jìn)程(single-organism process)(245個)等生物學(xué)過程相關(guān)GO term(圖4)。

        此外,上述新基因還可被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的101條通路,包括抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)(52個),碳代謝(carbon metabolism)(29個),氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)(27個),剪接體(spliceosome)(23個),糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)(20個),細(xì)胞周期-酵母(cell cycle-yeast)(20個),核糖體(ribosome)(18個),RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport)(18個),泛素介導(dǎo)的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)(15個)以及嘌呤代謝(purine metabolism)(14個)等(圖5),條目或通路后的括號內(nèi)數(shù)字代表注釋的新基因占比。

        圖5 蜜蜂球囊菌參考基因組中新基因的KEGG數(shù)據(jù)庫注釋

        2.5 蜜蜂球囊菌參考基因組中未注釋的新轉(zhuǎn)錄本的鑒定及功能注釋

        共鑒定出14 403條新轉(zhuǎn)錄本,其中分別有14 376, 8 524, 7 276, 7 405, 12 035, 7 891和6 855條新轉(zhuǎn)錄本可被分別注釋到Nr, Swiss-Prot, Pfam, KOG, eggNOG, GO和KEGG數(shù)據(jù)庫。Nr數(shù)據(jù)庫中新轉(zhuǎn)錄本注釋數(shù)量最多的物種是蜜蜂球囊菌,其次為Polytolypahystricis和Helicocarpusgriseus(圖6: A)。新轉(zhuǎn)錄本可被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫的25個功能類別,包括僅一般功能預(yù)測,翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成,翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,細(xì)胞內(nèi)移動、分泌和囊泡運(yùn)輸,能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換(energy production and conversion),RNA加工與修飾(RNA processing and modification),未知功能以及碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等(圖6: B)。此外,新轉(zhuǎn)錄本還可被注釋到eggNOG數(shù)據(jù)庫的25個功能類別,包括未知功能,翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成,翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶,細(xì)胞內(nèi)移動、分泌和囊泡運(yùn)輸,碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,轉(zhuǎn)錄,能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換,脂轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(lipid transport and metabolism)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等(圖6: C)。圖6括號內(nèi)數(shù)字代表注釋到該條目或通路的新轉(zhuǎn)錄本數(shù)量和占比。

        圖6 蜜蜂球囊菌參考基因組中新轉(zhuǎn)錄本的Nr(A)、KOG(B)和eggNOG(C)數(shù)據(jù)庫注釋

        上述新轉(zhuǎn)錄本還能被注釋到GO數(shù)據(jù)庫的44個功能條目,主要涉及細(xì)胞(4 494條),細(xì)胞組件(4 448條),細(xì)胞器(3 356條),細(xì)胞膜(2 332條),大分子復(fù)合物(macromolecular complex)(1 951條)等細(xì)胞組分相關(guān)GO term;催化活性(3 539條),結(jié)合(2 976條)等分子功能相關(guān)GO term;細(xì)胞進(jìn)程(4 281條),代謝進(jìn)程(4 055條),單一組織進(jìn)程(2 584條)等生物學(xué)過程相關(guān)GO term(圖7)。

        此外,這些新轉(zhuǎn)錄本還可被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的119條通路,注釋數(shù)量最多的是抗生素的生物合成(550條),其次是核糖體(495條),氨基酸的生物合成(284條),碳代謝(275條)及剪接體(253條)等(圖8)。

        圖8 蜜蜂球囊菌參考基因組中新轉(zhuǎn)錄本的KEGG數(shù)據(jù)庫注釋

        3 討論

        目前,蜜蜂球囊菌的基因組尚未組裝到染色體水平,其序列和功能注釋信息仍需進(jìn)一步優(yōu)化完善。此前,筆者所在課題組利用Illumina測序得到的短讀段數(shù)據(jù)對蜜蜂球囊菌的參考基因組注釋進(jìn)行完善,分別對51和50個已注釋基因的5′UTR和3′UTR進(jìn)行延長,鑒定出373個新基因并對部分新基因進(jìn)行了功能注釋(郭睿等, 2019)。Nanopore長讀段測序技術(shù)作為當(dāng)前主流的三代測序技術(shù)已成功應(yīng)用于人類(Leaetal., 2018)、大豆Glycinemax(Flemingetal., 2018)和桿狀病毒(Moldovánetal., 2018)等物種的全長轉(zhuǎn)錄組研究。然而對于絕大多數(shù)物種還沒有基于Nanopore長讀段測序數(shù)據(jù)完善基因組的研究報道。本研究利用前期已獲得的Nanopore長讀段測序數(shù)據(jù)對蜜蜂球囊菌的參考基因組注釋進(jìn)行完善,分別延長了4 744和4 737個已注釋基因的5′UTR和3′UTR,數(shù)量遠(yuǎn)多于此前基于二代測序數(shù)據(jù)延長的注釋基因數(shù)量,說明Nanopore長讀段測序技術(shù)在優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)方面具有顯著優(yōu)勢。鑒于UTR與真核生物的基因表達(dá)調(diào)控存在密切關(guān)系(Barrettetal., 2012),本研究中蜜蜂球囊菌基因的5′UTR和3′UTR的延長對于基因表達(dá)調(diào)控的深入研究具有重要意義。此外,本研究還預(yù)測出10 492個完整ORF,可為蜜蜂球囊菌基因全長序列的克隆及功能研究提供寶貴的參考信息。

        第二代分子標(biāo)記SSR是以1~6個核苷酸為重復(fù)單元組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列,具有實驗操作易、重復(fù)性好和多態(tài)性高等優(yōu)點(Jarne and Lagoda, 1996)。與傳統(tǒng)方法相比,利用二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR具有高通量的特點,使SSR的大規(guī)模開發(fā)成為現(xiàn)實(郭歡等, 2018; 黎東海和趙萍, 2019)。筆者所在課題組前期也基于RNA-seq數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)了中華蜜蜂Apisceranacerana(熊翠玲等, 2017)和意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(郭睿等, 2018)的SSR。目前,已開發(fā)和利用的蜜蜂球囊菌SSR較為有限。筆者所在課題組前期利用蜜蜂球囊菌的Illumina測序數(shù)據(jù)大規(guī)模挖掘出7 968個SSR,最主要的SSR類型是三核苷酸重復(fù)(53.15%),其次是二核苷酸重復(fù)(32.32%)和四核苷酸重復(fù)(8.46%)(李汶東等, 2017)。本研究共鑒定到5 286個SSR位點,其中最主要的類型同樣為三核苷酸重復(fù)(45.37%),其次為單核苷酸重復(fù)(35.38%)和二核苷酸重復(fù)(15.63%),表明基于三代長讀段數(shù)據(jù)和二代短讀段數(shù)據(jù)開發(fā)出的SSR類型相似,但也存在一些差異。但基于三代長讀段數(shù)據(jù)開發(fā)出的SSR總數(shù)明顯少于基于二代短讀段數(shù)據(jù)開發(fā)出的SSR總數(shù),究其原因,可能是前期基于二代測序數(shù)據(jù)組裝得到的unigene總數(shù)多達(dá)42 610個(李汶東等, 2017),遠(yuǎn)多于蜜蜂球囊菌參考基因組包含的基因總數(shù)(6 442),這是由于二代測序得到的片段較短(不超過300 bp),需要利用生物信息學(xué)軟件對短片段進(jìn)行拼接。下一步將通過毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記對兩種測序技術(shù)開發(fā)出的SSR進(jìn)行有效性和多態(tài)性檢測,進(jìn)而明確何種測序技術(shù)在大規(guī)模開發(fā)SSR方面更勝一籌。

        前期研究中,筆者所在課題組基于蜜蜂球囊菌的RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定到373個新基因(郭睿等, 2019)。本研究中,共鑒定到現(xiàn)有參考基因組未注釋的1 558個新基因,占注釋基因總數(shù)的24.19%,說明基于Nanopore長讀段測序數(shù)據(jù)較二代短讀段測序數(shù)據(jù)在鑒定新基因方面具有顯著優(yōu)勢。共有1 314個新基因注釋到蜜蜂球囊菌,與實際情況相符;分別有11和10個新基因注釋到P.hystricis和伊蒙微小菌(圖3: A),表明上述新基因在蜜蜂球囊菌與這兩個物種之間具有一定的保守性。共有1 177個新基因可注釋到eggNOG數(shù)據(jù)庫,但注釋到Swiss-Prot, Pfam, KOG, GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的新基因數(shù)量偏少,分別為731, 330, 592, 709和589個,說明這些數(shù)據(jù)庫收錄的蜜蜂球囊菌及近緣物種的蛋白功能注釋信息較少。蜜蜂球囊菌的成熟轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)體系迄今尚未建立,導(dǎo)致蜜蜂球囊菌的基因功能研究嚴(yán)重滯后。近期,Tauber等(2019)通過體外轉(zhuǎn)錄合成β-葡聚糖合成蛋白編碼基因以及Ras家族編碼基因雙鏈RNA(dsRNA)并處理蜜蜂球囊菌,結(jié)果顯示上述dsRNA可能在蜜蜂球囊菌孢子萌發(fā)初期被吸收,相關(guān)轉(zhuǎn)錄本受到抑制,孢子萌發(fā)率也相應(yīng)降低。該研究為蜜蜂球囊菌的基因功能研究提供了思路借鑒。現(xiàn)有的蜜蜂球囊菌參考基因組注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為6 442條,本研究鑒定到14 403條新轉(zhuǎn)錄本,高于注釋轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量,說明由于二代測序產(chǎn)生的短讀段的限制,蜜蜂球囊菌和其他物種的大量轉(zhuǎn)錄本有待挖掘,Nanopore長讀段測序技術(shù)在新轉(zhuǎn)錄本的鑒定方面大有作為。這些鑒定出的未注釋的全長轉(zhuǎn)錄本可為基因全長序列克隆及功能研究提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。新轉(zhuǎn)錄本注釋數(shù)量最多的物種同樣是蜜蜂球囊菌,與現(xiàn)實情況相符,分別有70和58條新轉(zhuǎn)錄本注釋到P.hystricis和H.griseus(圖6: A),與新基因的注釋情況略有差異。此外,分別有14 376, 8 524, 7 276, 7 405, 12 035, 7 891和6 855條新轉(zhuǎn)錄本可被分別注釋到Nr, Swiss-Prot, Pfam, KOG, eggNOG, GO和KEGG數(shù)據(jù)庫,這些信息可進(jìn)一步完善蜜蜂球囊菌的參考基因組注釋。

        綜上所述,本研究利用高質(zhì)量的Nanopore長讀段測序數(shù)據(jù)對現(xiàn)有的蜜蜂球囊菌參考基因組的序列和功能注釋進(jìn)行了完善,為相關(guān)組學(xué)及分子生物學(xué)研究的深入開展提供了重要的參考信息,也為其他物種的基因組完善提供了方法借鑒。

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