彭 露, 秦玉冬, 鄒明民, 董詩杰,劉莉莉, 尤民生,*

(1. 福建農(nóng)林大學, 閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室, 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學應用生態(tài)研究所, 福州 350002;3. 福建農(nóng)林大學, 教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實驗室, 福州 350002;4. 福建農(nóng)林大學, 福建省昆蟲生態(tài)重點實驗室, 福州 350002)

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是世界性的遷飛害蟲，主要危害十字花科植物，如蘿卜、薹菜、油菜、椰菜等(Ahujaetal., 2010)。研究證實，小菜蛾每年在全球范圍內(nèi)造成的損失和防治費約為40～50億美元(Zaluckietal., 2012; Furlongetal., 2013)，而每年在我國造成的損失和防治費則高達7億美元(Lietal., 2016)。在生產(chǎn)上人們采用了包括化學防治和生物防治在內(nèi)的各種防控方法，但效果仍不明顯。因此，尋求快速有效的控制小菜蛾危害的新方法亟不可待。

保幼激素(juvenile hormone, JH)作為一種親脂性的倍半萜類激素(R?ller and Dahm, 1967)，控制著昆蟲各個生長發(fā)育階段，對昆蟲發(fā)育變態(tài)的轉(zhuǎn)換起著重要作用，能直接作用于昆蟲生殖發(fā)育過程(Wyatt and Davey, 1996; Feietal., 2005)，也參與了昆蟲其他生理活動，如遷飛、營養(yǎng)利用、表型變化以及級型分化等(Sunetal., 2013; Xuetal., 2013; Mirthetal., 2014)。雖然JH是調(diào)控昆蟲生理過程最為重要的激素之一，但對其分子調(diào)控機制的研究仍然相對匱乏，主要受制于JH核受體的鑒定(周樹堂等, 2012)。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，烯蟲酯耐性(methoprene-tolerant, Met)蛋白是JH的核受體(Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2013)。

Met屬于basic-helix-loop-helix (bHLH)/Per-Arnt-Sim (PAS)轉(zhuǎn)錄因子家族成員(Ashoketal., 1998)，包括一段堿性DNA結(jié)合域的氨基酸序列(basic region)、一個螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(helix-loop-helix)、兩個空間可變的PAS結(jié)合域(PAS-A, PAS-B)和一個C末端(PAC)。已有研究表明，Met在昆蟲各個生理過程中具有重要作用，如控制昆蟲變態(tài)發(fā)育(Konopova and Jindra, 2007)與翅型分化(Lozano and Belles, 2014)，調(diào)控昆蟲卵巢發(fā)育、卵子形成、胚胎發(fā)育，產(chǎn)卵量以及交配行為等(Bilenetal., 2013; Guoetal., 2014; Marchaletal., 2014; Smykaletal., 2014; 彭露等, 2019)。Met通常以非共價形式與自身形成同質(zhì)二聚體存在于真核細胞中，在果蠅中發(fā)現(xiàn)了第一個Met與Met，以及Met與其同源蛋白Gce形成的同質(zhì)二聚體(Godlewskietal., 2006)。然而當JH存在時，Met形成的同質(zhì)二聚體需要解離，與該家族其他成員聚合成異質(zhì)二聚體，才能形成一個具有活性的轉(zhuǎn)錄因子，從而傳遞JH調(diào)控信號(Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2013)。不同種類昆蟲以及同種昆蟲中Met結(jié)合的bHLH-PAS家族成員類型可能并不相同，例如在家蠶Bombyxmori、蝗蟲與赤擬谷盜Triboliumcastaneum中，在JH信號作用下，Met可與同家族的steroid receptor co-activator(SRC)形成異質(zhì)二聚體調(diào)控JH通路下游基因的表達，從而調(diào)節(jié)其變態(tài)發(fā)育或生殖過程(Zhangetal., 2011; Kayukawaetal., 2012; Guoetal., 2014)。然而，埃及伊蚊AedesaegyptiMet與FISC(Ftz-F1-interacting steroid receptor coactivator)形成二聚體復合物調(diào)控下游基因表達(Lietal., 2011, 2014)。Shin等(2012)還發(fā)現(xiàn)，在JH信號作用下，埃及伊蚊Met蛋白與bHLH-PAS家族的Cycle蛋白形成異質(zhì)二聚體，與kr-h1基因啟動子上游的調(diào)控元件E-box-like基序結(jié)合，實現(xiàn)對kr-h1的表達調(diào)控，從而調(diào)節(jié)其生活節(jié)律。

迄今，對于Met蛋白的研究主要集中在模式昆蟲中，在小菜蛾中仍為空白。本研究對小菜蛾Met蛋白PxMet-1與PxMet-2進行了原核表達與純化，并利用分子對接技術(shù)解析了PxMet-1與PxMet-2與JH的結(jié)合模式，這將對篩選、鑒定及分析小菜蛾Met互作蛋白及其功能，深入闡明JH調(diào)控小菜蛾生殖發(fā)育的分子機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及飼養(yǎng)

供試昆蟲為敏感品系小菜蛾，其原始種群于2004年采自福建省福州市晉安區(qū)新店鎮(zhèn)菜地(26.08°N, 119.28°E)，經(jīng)過室內(nèi)的長期連續(xù)繼代培養(yǎng)，期間不使用任何農(nóng)藥，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度25±1℃、相對濕度(RH)70%～80%、光周期 16L∶8D，羽化后的小菜蛾成蟲采用蜂蜜水喂養(yǎng)，并放在塑料瓶中進行交配產(chǎn)卵。孵化的小菜蛾幼蟲在生長一周的蘿卜Raphanussativus(福州立信種苗)苗上取食，蘿卜苗種在人工氣候室，室內(nèi)溫度為 25±1℃，相對濕度約為75%，期間不使用任何農(nóng)藥。

1.2 小菜蛾Met基因的克隆驗證

從NCBI數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載已經(jīng)克隆鑒定的小菜蛾P(guān)xMet-1(GenBank登錄號: MK697672)和PxMet-2(GenBank登錄號: MK697673)開放閱讀框(ORF)全長序列(彭露等, 2019)，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，由尚亞生物技術(shù)(福州)有限公司合成。

選取5～8頭初羽化小菜蛾雌成蟲，置于滅菌后的2 mL離心管中，經(jīng)過液氮處理后采用Promega的RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μL產(chǎn)物用分光光度計測定RNA的濃度和質(zhì)量，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性，把合格的RNA樣品置于-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA采用Vazyme公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA第1鏈，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以合成的cDNA為模板，使用Vazyme公司的Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶，分別以Met-1 F1/Met-1 R1和Met-2 F1/Met-2 R1為引物擴增PxMet-1基因序列和PxMet-2序列片段1； 隨后用PxMet-2序列片段1連接pJET1.2載體的質(zhì)粒為模板，以Met-2 F2/Met-2 R1為引物擴增獲得PxMet-2序列片段2，最后用PxMet-2序列片段2連接pJET1.2載體的質(zhì)粒為模板，以Met-2 F3/Met-2R1為引物擴增獲得全長PxMet-2基因序列(表1)。反應體系: 2×Phanta Max Buffer 12.5 μL, cDNA模板1 μL, dNTP Mix(10 mmol/L)0.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, Super-Fidelity DNA Polymerase(1 U/μL)0.5 μL, 最后用ddH2O補足25 μL。PCR反應程序: 98℃預變性5 min; 98℃變性30 s, 55℃(PxMet-1)/65℃(PxMet-2)分別退火30 s, 72℃分別延伸1.5 min(PxMet-1)/2 min(PxMet-2),共34個循環(huán); 72℃延伸10 min。 反應結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V, 20 min)，利用試劑盒(OMEGA, 美國)純化回收目的片段，把膠回收的產(chǎn)物利用pJET1.2克隆載體(50 ng/μL)試劑盒進行連接，并轉(zhuǎn)化至50 μL大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞(天根)，隨后接種至帶有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃過夜培養(yǎng)，隨機挑取多個單克隆進行PCR驗證，鑒定陽性結(jié)果后送鉑尚生物技術(shù)(福州)有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.3 序列分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

通過SnapGene對測序獲得的序列與NCBI上小菜蛾Met進行比對；利用Expasy(https:∥web.expasy.org/cgi-bin/translate/dna2aa.cgi)預測開放閱讀框；應用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)鑒定PxMet-1和PxMet-2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；通過同源建模的SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)和穿線法的I-TASSER(https:∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)構(gòu)建蛋白三維模型。

1.4 PxMet-1和PxMet-2蛋白的原核表達

利用克隆獲得的PxMet-1和PxMet-2全長序列，設計帶有EcoR I和SacI酶切位點的PxMet-1特異性引物和帶有XhoI和Hind III酶切位點的PxMet-2特異性引物(表1)，并在下游引物末端加上His標簽。利用Met-1-EcoRI F/Met-1-SacI R和Met-2-Xho I F/Met-2-Hind III R引物(表1)，以pJET1.2-PxMet-1和pJET1.2-PxMet-2質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，反應體系和程序同1.2節(jié)。用對應的限制性內(nèi)切酶酶切后回收，連接至pGEX-KG載體，把上述的連接產(chǎn)物pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)表達感受態(tài)細胞中，進行菌落PCR，以菌液為模板，用通用引物T7-F和T7-R(表1)進行菌液PCR驗證。取含有重組質(zhì)粒的保存菌液，按1%的接種量接種到新鮮的含有50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜活化；取活化菌液按1∶100比例加入到1 000 mL的上述培養(yǎng)基中，保持37℃，待OD600=0.6～0.8時加入不同濃度的IPTG進行誘導表達(PxMet-1: 0.3 mmol/L IPTG在16℃下誘導16 h; PxMet-2: 0.1 mmol/L IPTG在16℃下誘導16 h)。重組菌體經(jīng)超聲波破碎后(新芝超聲破碎儀，頻率200 Hz，超聲破碎2 s，間歇4 s，總時間30 min), 4℃, 14 000 r/min, 30 min離心分別收集上清和沉淀。10% SDS-PAGE檢測融合蛋白。

1.5 PxMet-1和PxMet-2融合蛋白的純化與鑒定

使用AKTA pure 25蛋白純化系統(tǒng)，并選擇His和GST 標簽進行純化。pGEX-KG-PxMet-1與pGEX-KG-PxMet-2純化分別使用His TrapTMHP 5 mL(GE Healthcare，美國)與GST TrapTMHP 5 mL(GE Healthcare，美國)柱子純化。分別使用咪唑溶液(濃度梯度為0, 20, 150和500 mmol/L)和還原型谷胱甘肽溶液(20 mmol/L)洗脫PxMet-1與PxMet-2融合蛋白。洗脫出的PxMet-1與PxMet-2融合蛋白分別用30與50 kD的超濾管濃縮脫鹽(Millipore，美國)。最后對純化的蛋白進行SDS-PAGE檢測和Western blot驗證，Western blot驗證分別使用His和GST標簽蛋白抗體，純化的蛋白用Solarbio的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定融合蛋白濃度。

1.6 PxMet-1和PxMet-2與保幼激素的結(jié)合模式分析

把PxMet-1和PxMet-2序列放到在線同源建模網(wǎng)站預測，找到相似度最高的同源模板PDB，利用該模板到薛定諤軟件中進行同源建模(Jacobsonetal., 2004)，在ChemDraw軟件中畫出JH I, JH II和JH III 3種保幼激素的結(jié)構(gòu)式，把其結(jié)構(gòu)式小分子文件放到薛定諤軟件中與構(gòu)建的蛋白模型進行分子對接(Linetal., 2018)。參考已報道的赤擬谷盜Met與JH結(jié)合位點(Charlesetal., 2011)，利用軟件預測PxMet的分子對接口袋。

2 結(jié)果

2.1 PxMet-1和PxMet-2克隆驗證

PCR克隆驗證結(jié)果顯示，克隆獲得的PxMet-1和PxMet-2全長cDNA序列分別為1 575和2 100 bp(圖1)，與NBCI數(shù)據(jù)庫記載的序列長度一致。比對分析顯示，PxMet-1測序結(jié)果與原序列核苷酸一致性為100%，PxMet-2(GenBank登錄號: MT996234)測序結(jié)果與原序列存在1個非同義突變，突變位點為第41位氨基酸，由甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala)(圖2)，核苷酸序列一致性為99.9%。

2.2 PxMet-1和PxMet-2的三維結(jié)構(gòu)

從SWISS-MODEL和I-TASSER預測的三維結(jié)構(gòu)(圖2)可以看出兩種方法預測出的蛋白模型結(jié)構(gòu)都相似，且PxMet-1與PxMet-2蛋白都包含典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(helix-loop-helix)。

圖1 小菜蛾P(guān)xMet-1(A)和PxMet-2(B)基因克隆

圖2 小菜蛾Met蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

2.3 PxMet-1和PxMet-2的原核表達

菌液PCR檢測結(jié)果顯示，構(gòu)建的pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2重組質(zhì)粒均獲得預期大小的條帶，陽性克隆子測序結(jié)果也與構(gòu)建的重組載體序列一致(圖3)。

pGEX-KG-PxMet-1表達產(chǎn)物成熟肽部分的核苷酸序列含有2 325個堿基，編碼774個氨基酸，記作PxMet-1融合蛋白，預測分子質(zhì)量為89.2 kD；pGEX-KG-PxMet-2表達產(chǎn)物成熟肽部分的核苷酸序列含有2 859個堿基，編碼952個氨基酸，記作PxMet-2融合蛋白，預測分子質(zhì)量為106 kD；兩個融合蛋白均包括GST和His標簽蛋白。不同條件的誘導表達，結(jié)果顯示，PxMet-1與PxMet-2融合蛋白分別在0.3和0.1 mmol/L IPTG 16℃誘導16 h表達量最高。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，pGEX-KG-PxMet-1與對照(pGEX-KG)相比在89.2 kD處多一條條帶，且與PxMet-1融合蛋白大小一致；而pGEX-KG-PxMet-2與對照相比在106 kD處多一條條帶，且與PxMet-2融合蛋白大小一致，表明構(gòu)建的原核表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)PxMet-1與PxMet-2融合蛋白的原核表達(圖4: A)。

把收集的菌體用超聲波破碎后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE表達檢測，結(jié)果顯示，上清和沉淀中均檢測到對應大小的PxMet-1與PxMet-2融合蛋白條帶(圖4: B)，說明兩種蛋白在上清和沉淀中都有表達。我們選擇上清中的蛋白進行純化分析。

圖3 重組質(zhì)粒pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌液PCR

圖4 小菜蛾融合蛋白PxMet-1和PxMet-2的誘導表達

2.4 PxMet-1和PxMet-2融合蛋白的純化

PxMet-1融合蛋白使用HisTrapTMHP 5 mL柱子進行純化，結(jié)果表明，不同濃度咪唑都能把PxMet-1融合蛋白洗脫下來，其中在150 mmol/L咪唑濃度下，被洗脫下來的融合蛋白純度最高(圖5: A)。PxMet-2融合蛋白使用GSTTrapTMHP 5 mL柱子進行親和層析，結(jié)果顯示，使用20 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫時，被洗脫下來的融合蛋白純度最高(圖5: B)。

圖5 小菜蛾P(guān)xMet-1(A)和PxMet-2 (B)融合蛋白純化的SDS-PAGE檢測

2.5 PxMet-1和PxMet-2融合蛋白的鑒定

純化的融合蛋白進行SDS-PAGE檢測和Western blot驗證。SDS-PAGE結(jié)果顯示，PxMet-1和PxMet-2分別純化獲得單一的目的蛋白條帶，條帶大小與預期的結(jié)果相符(圖6: A, B)；Western blot結(jié)果顯示PxMet-1和PxMet-2融合蛋白分別在89.2與106 kD位置獲得條帶(圖6: C, D)，表明純化獲得的蛋白為PxMet-1和PxMet-2的融合蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，純化的蛋白濃度都大于1 mg/mL。

圖6 小菜蛾P(guān)xMet-1和PxMet-2融合蛋白SDS-PAGE (A, B)和Western blot (C, D)驗證

2.6 PxMet-1和PxMet-2與JH的結(jié)合模式

分子對接口袋預測結(jié)果顯示，PxMet-1與PxMet-2的分子對接口袋分別為: PxMet-1: 341Phe, 307Thr, 309His, 350Val, 354Leu和333Val; PxMet-2: 358Leu, 354Val, 311Thr, 313His, 392Thr, 337Val和345Phe。

隨后我們選擇了常見的JH I, JH II和JH III 3種分子與PxMet-1和PxMet-2分別進行分子對接。對接分數(shù)反映了小分子和靶標蛋白結(jié)合的強弱。結(jié)果顯示，PxMet-1和PxMet-2與3種JH分子都存在結(jié)合作用，其中PxMet-1與JH II結(jié)合作用最強，結(jié)合分數(shù)為-10.746，而PxMet-2與JH I結(jié)合作用最強，其結(jié)合分數(shù)為-9.469。分子對接分析結(jié)果還顯示，為PxMet-1和PxMet-2與JH存在相互作用位點(如圖7和8中紫色箭頭所示)，所有位點均在對接口袋內(nèi)，且位于PAS-B保守結(jié)構(gòu)域，與已報道的赤擬谷盜Met與JH結(jié)合位點(Charlesetal., 2011)相同，推測PxMet蛋白同樣也是小菜蛾JH分子的作用受體。

圖7 分子對接分析小菜蛾P(guān)xMet-1與JH的結(jié)合模式

圖8 分子對接分析小菜蛾P(guān)xMet-2與JH的結(jié)合模式

3 討論

本研究通過克隆驗證小菜蛾P(guān)xMet-1和PxMet-2基因，與NCBI數(shù)據(jù)庫記載的序列相比對(彭露等, 2019)，PxMet-1與原記載序列的核苷酸序列一致性為100%，PxMet-2僅在第41位氨基酸由Gly突變?yōu)锳la，與原記載序列的核苷酸序列一致性高達99.9%，說明我們獲得的序列信息準確，可用于后續(xù)的載體構(gòu)建。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，PxMet-1和PxMet-2與其他已知昆蟲Met蛋白一致，都具有該家族的保守結(jié)構(gòu)域(Konopova and Jindra, 2007; Lietal., 2011; Suetsuguetal., 2013; Linetal., 2015)，表明小菜蛾Met基因在進化過程較為保守。其中，bHLH結(jié)構(gòu)域主要是真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，具有與DNA結(jié)合的作用，并在生物的一系列生理過程中發(fā)揮著決定性作用；PAS蛋白主要參與K+通道信號傳遞，PAS結(jié)構(gòu)域是一個信號敏感域，可以促進PAS蛋白之間或與其他核受體蛋白的相互作用，PAC結(jié)構(gòu)域則與PAS結(jié)構(gòu)域的折疊有關(guān)(Ashoketal., 1998; Miuraetal., 2005; Jindraetal., 2013)，由此我們推測小菜蛾Met基因與其家族其他成員一樣主要在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。同時利用SWISS-MODEL與I-TASSER構(gòu)建蛋白模型，結(jié)果顯示，這兩種方法構(gòu)建的PxMet蛋白模型結(jié)構(gòu)相似，都包含典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，說明我們構(gòu)建的蛋白模型可信度較高，可以用于后續(xù)的蛋白結(jié)構(gòu)與結(jié)合特性分析(Linetal., 2018)。

本研究構(gòu)建了PxMet-1和PxMet-2蛋白的原核表達載體pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2，并轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞表達菌株，PxMet-1與PxMet-2分別通過0.3與0.1 mmol/L IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2分別在89.2與106 kD 處產(chǎn)生特異性條帶，且符合推測大小，表明PxMet-1與PxMet-2融合蛋白已被成功表達，且在上清和沉淀中都有表達。最后分別利用HisTrapTMHP與GSTTrapTMHP柱親和層析純化獲得高純度PxMet-1與PxMet-2融合蛋白，為進一步的互作蛋白篩選與功能研究奠定了基礎。

在PxMet與JH的結(jié)合模式分析過程中，我們選擇了常見的JH I, JH II和JH III進行分子對接分析。我們發(fā)現(xiàn)，Met蛋白通過PAS-B結(jié)構(gòu)域形成具有較高親和力的口袋型來結(jié)合JH，這與其他的研究結(jié)果(Miuraetal., 2005; Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2013)較一致，也與PAS結(jié)構(gòu)域可以促進PAS蛋白之間或與其他核受體蛋白的相互作用結(jié)論一致，由此我們推測，PxMet-1與PxMet-2蛋白同樣也是小菜蛾JH分子的作用受體。前期研究證實，PxMet-1與PxMet-2具有齡期表達偏好性，PxMet-1與PxMet-2分別在蛹期與成蟲期相對高表達(彭露等, 2019)。Jindra等(2013)表明，JHⅠ和JHⅡ是鱗翅目特有的，幼蟲咽側(cè)體只分泌這兩種化合物，而成年雌性咽側(cè)體除了產(chǎn)生JHⅠ和JHⅡ外還產(chǎn)生JHⅢ。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PxMet-1與JH II結(jié)合作用最強，PxMet-2與JHⅢ結(jié)合作用最強，說明PxMet-1與PxMet-2作用的時期，以及分子機制并不相同。

本研究進一步克隆驗證了小菜蛾Met基因PxMet-1和PxMet-2的全長序列，解析了PxMet-1和PxMet-2的三維結(jié)構(gòu)，并完成了PxMet-1和PxMet-2的原核表達與純化，最后分析了PxMet-1和PxMet-2與JH的結(jié)合模式，為闡明JH調(diào)控小菜蛾發(fā)育與生殖過程的分子信號途徑提供了初步的依據(jù)。PxMet-1與 PxMet-2的互作蛋白篩選，以及它們介導的分子調(diào)控機制仍有待我們進一步研究。