劉泓淵 成剛 李宗平( 通訊作者)

( 綿陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科 四川 綿陽 621000）

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞性腫瘤[1]。盡管經(jīng)過積極的治療，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍較差。膠質(zhì)瘤的預(yù)后與腫瘤分期、遺傳和表觀遺傳學(xué)分子特征等生物學(xué)和臨床特征相關(guān)。DNA 甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一部分，被認為是人類腫瘤常見的分子學(xué)改變，通常發(fā)生在CpG 位點。在正常組織中，大量基因的CpG 位點未發(fā)生甲基化，但是在腫瘤中發(fā)生甲基化，如乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸癌、前列腺癌和膠質(zhì)瘤。CpG 序列富集的DNA片段叫CpG 島。CpG 島甲基化與抑癌基因轉(zhuǎn)錄沉默密切相關(guān)。

乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑（maspin）在乳腺、前列腺、口腔等組織中表達，在上述癌組織中表達下調(diào)。Maspin 在正常腦組織及膠質(zhì)瘤中的表達水平罕見報道。有研究表明在眾多腫瘤中maspin 受表觀遺傳學(xué)調(diào)控，主要涉及到CpG 島甲基化。生物信息學(xué)分析表明maspin 具有6 個CpG 島，其中1 個位于啟動子區(qū)，而maspin 在膠質(zhì)瘤中表達沉默。本文旨在探索maspin 基因在膠質(zhì)瘤中表達沉默與表觀遺傳學(xué)的關(guān)系。

1.資料和方法

1.1 主要材料

人前列腺癌細胞株P(guān)C3( 陽性對照)、膠質(zhì)瘤細細胞株U343 來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-A z a-DC)來源于Sigma 公司，10% 胎牛血清為Hyclone 公司產(chǎn)品，RNA 提取試劑購自Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNA 提取試劑盒為Fermentas 公司產(chǎn)品，甲基化試劑盒購自Zymo Research 產(chǎn)品。Maspin 引物由Invitrogen 設(shè)計、合成。MethPrimer 設(shè)計甲基化引物和非甲基化引物，primer6.0 設(shè)計內(nèi)參GAPDH 基因引物。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及100U/m L 濃度的雙抗的完全培養(yǎng)液。細胞置于37℃、5%CO2，相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中。細胞貼壁生長，用胰酶消化傳代。

1.3 RT-PCR 測定maspin 基因轉(zhuǎn)錄

提取PC3、U343 的R N A 并逆轉(zhuǎn)錄，PCR 擴增。Maspin基因引物序列為，上游5’-ctcgcttgcctgttcctt-3’，下游：5’-cgtagagccgcttgattagt-3’；GAPDH 為內(nèi)參照，上游：5’-aatgggcagccgttaggaaa-3’，下游：5’-gcccaatacgaccaaatcagag -3’。PCR 擴增條件：94℃ 5min；94 ℃ 30s、52 ℃ 30s、72 ℃ 30s，33 循 環(huán)；72 ℃ 7min。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用Quantity One 對產(chǎn)物條帶進行分析。

1.4 5-Aza-DC 處理

將膠質(zhì)瘤細胞消化計數(shù)，以1×105個細胞/m L 的密度培養(yǎng)24h，分別加入終濃度為0μ M( 對照) 和12μ M 5-Aza-dC 培養(yǎng)96h,按照1.3 中方法提取RNA，檢測maspin轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 甲基化特異性PCR（MSP）檢測maspin 基因啟動子甲基化

MethPrimer 設(shè)計甲基化引物maspin（Mmaspin）及非甲基化maspin(Umaspin)。DNA 試劑盒提取PC3 及U343 DNA，使用甲基化試劑盒對二者DNA 進行修飾。采用Mmaspin 和Umaspin 引物檢測maspin 基因的DNA 甲基化情況。Mmaspin引物序列序列，上游：5’-ttttatcgaatattttatttttcgg-3’，下游：5’-gataactcacctaaacaacaccg-3’；Umaspin 引物序列，上游：5’-ttttattgaatattttattttttgg-3’；下游：5’-caataactcacctaaacaacaccac-3’。擴增條件：94℃ 5min；94℃30s、56℃ 30s、72℃ 30s，40 個循環(huán)；72℃ min。瓊脂糖凝膠電泳后使用Quantity One 對產(chǎn)物條帶進行分析。

1.6 亞硫酸氫鹽測序法(BSP)對啟動子區(qū)域甲基化CpG位點進行檢測

MethPrimer 軟件設(shè)計BSP 引 物， 上 游：5-ga gaaatttgtagtgttattattattatat-3’， 下 游：5’-ataactcacctaaacaacacc-3’。使用甲基化試劑盒對P C3、U343 的DNA 進行甲基化修飾并擴增。擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s，40個循環(huán)；72℃ 7min。B S P 產(chǎn)物進行測序后使用FinchTV version1.4.0 和Sequence Scanner v1.0 分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理，計數(shù)資料采用率（%）表示，行χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 PC3、U343 中maspin 基因的轉(zhuǎn)錄水平

運用RT-PCR 檢測PC3、U343 細胞中maspin 轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明，在PC3 中maspin 基因轉(zhuǎn)錄表達，在U343 細胞中被表達沉默，見圖1。

圖1 A、B 為 RT-PCR 檢測PC3、U343 細胞中 maspin 轉(zhuǎn)錄水平。*P ＜0.01。

2.2 5-Aza-DC 影響U343 細胞maspin 表達

使用0μM（對照），12μM5-Aza-dC 處理U343 細胞后，使用 RT-PCR 探查maspin 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，經(jīng)過12μM 5-Aza-dC處理后maspin 在U343 細胞中恢復(fù)轉(zhuǎn)錄，見圖2A。處理組和未處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），見圖2B。結(jié)果顯示maspin 在U343 細胞中的表達抑制可能與表觀遺傳學(xué)中的DNA 甲基化相關(guān)。

圖2 A：5-Aza-DC 處理前后，運用RT-PCR 檢測 maspin 基因表達水平變化。B：經(jīng)5-Aza-DC 干預(yù)或未干預(yù)后細胞中 maspin 相對含量灰度值變化（-：未干預(yù)，+：干預(yù)）。*P ＜0.01。

2.3 Maspin 基因啟動子甲基化分析

MSP 結(jié)果顯示表明，maspin 基因啟動子在PC3 細胞（對照組）中處于非甲基化狀態(tài)，而在U343 細胞中處于甲基化狀態(tài)，見圖3。

圖3 亞硫酸鹽修飾PC3 及U343 細胞DNA 后，使用MSP 檢測maspin 啟動子在各組細胞中的甲基化狀態(tài)。U：非甲基化擴增，M：甲基化擴增。

2.4 Maspin 基因啟動子區(qū)域CpG 位點甲基化分析

BSP 測序結(jié)果顯示在U343 細胞中預(yù)期的甲基化位點中胞嘧啶未發(fā)生轉(zhuǎn)變發(fā)生了甲基化。而在PC3 細胞中預(yù)期的位點中胞嘧啶發(fā)生轉(zhuǎn)變未發(fā)生甲基化，見圖4。

圖4 各組細胞DNA 經(jīng)亞硫酸鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶C 轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，而甲基化則不變?nèi)詾镃。PC3 中C 均轉(zhuǎn)化為T，而U343 中C 均未轉(zhuǎn)化為T。

3.討論

Maspin 是1994 通過消減雜交法和差異顯示分析技術(shù)從乳腺上皮細胞中分離的候選抑制基因，編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑。Maspin 基因在包括乳腺、前列腺等眾多組織中表達，然而在上述腫瘤中表達下降。而maspin 在膠質(zhì)瘤中表達情況少有報道。通過RT-PCR 檢測分析發(fā)現(xiàn)U343 細胞中不表達maspin 基因。Maspin 具有調(diào)節(jié)細胞浸潤、降低細胞運動能力、抑制腫瘤血管的生成等抑癌基因特性。因而研究maspin 在膠質(zhì)瘤中沉默機制具有重要的意義。

DNA 甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要修飾方式，啟動子區(qū)域DNA 異常甲基化是基因表達沉默常見的機制[2]。異常的DNA 甲基化通常CpG 區(qū)，富集CpG 序列DNA 片段叫CpG 島。5-Aza-DC 通過抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶使DNA 去甲基化使基因恢復(fù)轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮正常功能[3-4]。據(jù)報道，膠質(zhì)瘤的發(fā)生與甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活相關(guān)，如EMP3 基因。通過5-Aza-DC 干預(yù)U343 細胞后maspin 基因重新轉(zhuǎn)錄表達表明，其表達沉默與DNA 甲基化有緊密的聯(lián)系。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)maspin 基因啟動子區(qū)存在CpG 島，更加證實了兩者的相關(guān)性。

MSP 是檢測DNA 甲基化的有效方法[5]。亞硫酸鹽處理膠質(zhì)瘤的DNA 后，未甲基化的胞嘧啶C 轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶C 不變。MSP 結(jié)果反映在U343 細胞中maspin 基因啟動子區(qū)域處于甲基化狀態(tài)。使用亞硫酸氫鹽測序法進一步探索其甲基化CpG 位點。測序發(fā)現(xiàn)maspin 啟動子區(qū)域的預(yù)期甲基化CpG 位點均發(fā)生了甲基化。

上述研究表明，maspin 在膠質(zhì)瘤中的表達沉默與其啟動子CpG 島甲基化有關(guān)，DNA 甲基化抑制劑5-Aza-DC 可誘導(dǎo)maspin基因在U343 細胞中恢復(fù)表達。