李艷芳 王燕（通訊作者） 石明雋

（1 貴州省腫瘤醫(yī)院 貴州 貴陽 550001）

（2 貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室 貴州 貴陽 550025）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是全球臨床常見惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，近10 年來結(jié)直腸癌在中國(guó)的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生涉及到多種癌基因的激活和抑癌基因的失活；Wnt 信號(hào)通路的異常活化與腫瘤形成密切相關(guān)，其中分泌型卷曲蛋白受體相關(guān)蛋白1(secreted frizzled-related proteins family，SFRP1)作為Wnt 信號(hào)通路的抑制因子,被證實(shí)是一種抑癌基因。

抑癌基因表達(dá)沉默是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制，而DNA 甲基化是抑癌基因表達(dá)沉默的重要途徑之一。研究顯示，SFRP1 異常甲基化普遍存在結(jié)直腸癌中，而SFRP1 甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)下降或沉默的主要原因之一[2-3]。DNA 甲基化主要通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase DNMTs）的催化和維持。真核生物中已明確的DNMTs 包括三個(gè)活動(dòng)形式，即DNMT1，DNMT3a 和DNMT3b，其中DNMT3a 和DNMT3b 能在不需要模板鏈的指導(dǎo)下使未發(fā)生甲基化的DNA 雙鏈上進(jìn)行甲基化修飾[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，DNMT3a和DNMT3b過表達(dá)可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。國(guó)外部分學(xué)者進(jìn)一步對(duì)SFRP1 與DNMTs 之間可能存在的關(guān)系進(jìn)行了研究[8-9]，推測(cè)DNMT3a 和DNMT3b 過表達(dá)與SFRP1 異常甲基化呈負(fù)相關(guān)性可能。但國(guó)內(nèi)尚未有同時(shí)在結(jié)直腸癌組織中檢測(cè)SFRP1、DNMT3a 和DNMT 3b 的表達(dá)情況及分析其相關(guān)性的研究。

故本研究通過免疫組織化學(xué)染色及Western Blot 蛋白印記法分別檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織中SFRP1、DNMT3a 和DNMT 3b 蛋白的表達(dá)情況，分析相互之間可能存在的相關(guān)性及對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的作用，為DNMTs 抑制劑應(yīng)用于臨床預(yù)防及治療結(jié)直腸癌提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集自2018 年2—10 月貴州省腫瘤醫(yī)院胃腸外科經(jīng)臨床病理明確診斷為結(jié)直腸腺癌并經(jīng)根治術(shù)后切除的結(jié)直腸癌組織及距病灶2cm 的癌旁組織各36 例，術(shù)前均未經(jīng)放化療治療。36 例癌組織中男性18 例，年齡27 ～75 歲，平均年齡（58.22±14.26），女性18 例，年齡23 ～83 歲，平均年齡（57.83±14.72）；結(jié)腸癌19 例（包括右半結(jié)腸8 例，橫結(jié)腸2 例，左半結(jié)腸9 例），直腸癌17 例；高分化12 例，中分化14 例，低分化10 例；浸潤(rùn)深度為T1+T2 的7 例，T3+T4 的29 例；有淋巴結(jié)結(jié)轉(zhuǎn)移的15 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的21 例；TNM 分期為Ⅰ、Ⅱ期的21 例，Ⅲ、Ⅳ期的15 例。

1.2 免疫組化法檢測(cè)目的蛋白

烤片60℃ 2h 后，常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶、檸檬酸緩沖液微波爐煮沸抗原修復(fù)、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 次后，分別滴加經(jīng)PBS 稀釋后的一抗，即SFRP1(1:200)、DNMT3b（1:400）、DNMT3a（1:600），同時(shí)以PBS 作為陰性對(duì)照，均放置于濕盒中4℃孵育過夜；復(fù)溫30 min，PBS 洗3 次后，37℃孵育相應(yīng)二抗1h。PBS 洗3 次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯微鏡下染色，流水沖洗，蘇木素鏡下復(fù)染，流水沖洗后常規(guī)脫水透明、晾干，中性樹脂封片干燥后后鏡下觀察蛋白表達(dá)。

1.3 免疫蛋白印跡檢測(cè)

從-80℃冰箱取出癌組織及癌旁組織標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本稱取約100mg，按照蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，按比例加入1.5 倍緩沖液配置成蛋白樣品，震蕩混勻，100℃，煮沸10min，使蛋白充分變性，-20℃保存待用。用前解凍，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、相應(yīng)一抗即SFRP1(1:500)、β-catenin(1:500)、DNMT3A(1:300)、DNMT3B(1:300)4℃冰箱搖床孵育過夜。次日，經(jīng)TBST 漂洗3 次后，用1%脫脂牛奶稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1:8000)、兔抗羊IgG(1:8000)，室溫?fù)u床慢搖孵育1h；洗膜后ECL 顯影曝光。檢測(cè)各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，圖像采用 BIO-RAD 圖像處理軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩變量相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)分析，均做雙側(cè)檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1 SFRP1 蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)顯示：SFRP1 蛋白主要在結(jié)直腸組織的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，見圖1。SFRP1 在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率（11/36，30.6%）顯著低于癌旁對(duì)照組織（27/36，75.0%），兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖1 免疫組織化學(xué)顯示SFRP1 在結(jié)直腸癌旁組織及癌組織中的表達(dá)（×200）

2.2 DNMT3a 蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

DNMT3a 蛋白主要在結(jié)直腸組織的細(xì)胞核中表達(dá)，見圖2。其中DNMT3a 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)（21/36，58.3%），高于癌旁對(duì)照組織（5/36，13.9%），兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 DNMT3a 在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中免疫組化染色（×200）

2.3 DNMT3b 蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

DNMT3b 蛋白主要在結(jié)直腸組織的細(xì)胞核中表達(dá)，見圖3。其中DNM T3b 在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率（19/36，52.8%），高于癌旁組織（3/36，8.3%），兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖3 DNMT3b 在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中免疫組化染色（×200）

2.4 免疫蛋白印跡結(jié)果顯示

與癌旁組織比較（0.8±0.24），SFRP1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著降低（0.52±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4；DNMT3a 蛋白和DNMT3b 蛋白表達(dá)在癌組織中均明顯增高，DNMT3a 蛋白在癌組織和癌旁組織的相對(duì)表達(dá)分別為3.94±0.31，1.38±0.23，DNMT3b 蛋白在癌組織和癌旁組織的相對(duì)表達(dá)分別為1.73±0.44，0.40±0.15，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖5、圖6。

圖4 Western blot 顯示SFRP1 在結(jié)直腸癌旁組織及癌組織中的相對(duì)表達(dá)

圖5 Western blot 顯示DNMT3b 在結(jié)直腸癌旁組織及癌組織中的相對(duì)表達(dá)

圖6 Western blot 顯示DNMT3a 在結(jié)直腸癌旁組織及癌組織中的相對(duì)表達(dá)

2.5 SFRP1、DNMT3a 及DNMT3b 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理資料之間的關(guān)系

SFRP1 及DNMT3a 的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤位置、大小及分化程度無顯著關(guān)系（P ＞0.05），但SFRP1 表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P ＜0.05）；DNMT3a 表達(dá)與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P ＜0.05）。DNMT3b 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、位置、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM 分期均無關(guān)系（P ＞0.05）。

2.6 SFRP1 與DNMT3a、3b 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman 等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，SFRP1 與DNMT3a、3b 表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.540，P ＜0.05；r=-0.339，P ＜0.05），見表1、表2。

表1 結(jié)直腸癌組織中SFRP1 與DNMT3a 蛋白表達(dá)的關(guān)系

表2 結(jié)直腸癌組織中SFRP1 與DNMT3b 蛋白表達(dá)的關(guān)系

3.討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生通過大量遺傳和表觀遺傳改變的積累，可能導(dǎo)致正常腸上皮轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)性腺癌。SFRP1 作為腫瘤抑制基因，被證實(shí)能抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)CRC 細(xì)胞凋亡[10]。另外，王巍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中 SFRP1 mRNA 表達(dá)顯著低于癌旁組織，而結(jié)直腸癌組織中的SFRP1 甲基化頻率卻顯著高于癌旁組織，均說明SFRP1 甲基化可引起SFRP1 在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)。本研究通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)直腸癌的癌組織及癌旁組織中SFRP1 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，相對(duì)癌旁組織，SFRP1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著降低，且SFRP1 表達(dá)下調(diào)與結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期相關(guān)。免疫蛋白印跡檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)SFRP1 在癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織中。由此得出，在結(jié)直腸癌中SFRP1 能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其表達(dá)下降參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

DNA 甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)家族催化和維持的。本研究通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織中的DNMT3a 及DNMT3b 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者在癌組織中的表達(dá)均顯著高于癌旁組織，同時(shí)在Western Blot 實(shí)驗(yàn)中也得到相同結(jié)果。因此本研究從組織水平上證實(shí)了DNMT3a、3b 在結(jié)直腸癌中過表達(dá)，可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生，與過去研究結(jié)果一致。

過去部分研究[12]顯示，在結(jié)直腸癌中DNMTs 過表達(dá)與其靶基因DNA 甲基化有顯著關(guān)系，并導(dǎo)致其靶基因轉(zhuǎn)錄失活；并有學(xué)者探討DNMTs 過表達(dá)與靶基因之間可能存在的相關(guān)性，推測(cè)兩者之間可能存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示SFRP1 在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著降低，而DNMT3a、3b 表達(dá)異常升高，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SFRP1表達(dá)與DNMT3a、3b 表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)，所以推測(cè)在結(jié)直腸癌中，DNMT3a、3b 異常高表達(dá)可能促進(jìn)了SFRP1 的異常甲基化，這將為臨床上DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑作為靶向藥物用于預(yù)防及治療結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。