王立 劉永強 王耀華 李博 高華坤 彭程 李文平 付澤嫻

河北工程大學附屬醫(yī)院泌尿外科，邯鄲056002

0 引 言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是最常見的惡性腫瘤之一，也是西方男性癌癥相關死亡的第二大原因[1]。PCa 死亡率高的主要原因是其對骨和/或其他器官的高轉(zhuǎn)移率[2-3]。盡管對前列腺癌的研究已取得重大進展，但有關前列腺癌轉(zhuǎn)移的預防和治療仍然是一項重大挑戰(zhàn)，因為PCa 轉(zhuǎn)移和侵襲的具體分子機制尚未被完全闡明。前列腺特異性抗原（prostatespecific antigen，PSA）是用于預防、診斷和監(jiān)測PCa的癌癥生物標志物[4]。然而，通過檢測患者血清中的PSA 水平來監(jiān)測PCa 的臨床進展和預后的意義較小。因此，迫切需要更有效的生物標志物來區(qū)分高風險和低風險的PCa 患者，以便在臨床早期階段優(yōu)化和個體化治療策略。

微小RNA（microRNA，miRNA）是短的非編碼單鏈RNA 分子，由大約18～22 個核苷酸組成，對分子信號傳導途徑具有廣泛的調(diào)節(jié)活性。miRNA 作為一類小的非編碼RNA，通過對mRNA 的切割、抑制翻譯、mRNA 的去穩(wěn)定化或以上機制的同時作用來沉默靶標mRNA[5]。miRNA 在細胞轉(zhuǎn)移過程中有關鍵作用，主要由于它們對細胞運動、遷移和侵襲的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有影響。許多研究結(jié)果顯示，miRNA 在PCa 中具有潛在作用[6]。然而，關于miRNA 對PCa的進展和轉(zhuǎn)移的作用方式，研究者知之甚少。最近研究者發(fā)現(xiàn)，體液中某些miRNA 的表達可以作為癌癥早期診斷的有效生物標志物[7]。另有研究報道，miR-497 在PCa 中異常表達[8]。本研究中，主要探討miR-497 對前列腺癌細胞生長侵襲的影響及前列腺癌細胞對奧沙利鉑藥物的敏感性，分析miR-497 在前列腺癌中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

前列腺癌細胞系PC3-AR（美國ATCC 細胞庫），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國 GIBCO 公司），SYBR Premix Ex TaqTM（日本 Takara 公司），lipfectine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國 Invitrogen 公司），8.0 μm 孔徑 Transwell 小室（美國 Millipore 公司），Matrigel（美國 BD Biosciences 公司），Annexin VFITC/PI（美國Roche 公司），抗基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶8（cyclin-dependent kinases 8,CDK8）、IκB 激酶 β（inhibitor kappa B kinase β，IKKβ）、PSA及肌動蛋白（β-actin）（美國 CST 公司），硝酸纖維素膜（美國Bio-Rad 公司）。

CFX96 實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國 Bio-Rad 公司），低溫高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher 公司），熒光素酶活性檢測儀（美國Promega 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

前列腺癌細胞系PC3-AR 培養(yǎng)于含有10%FBS、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml 的DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 RNA 的提取和qRT-PCR

用Trizol 試劑從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA。將所示基因的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，用 SYBR Premix Ex TaqTM在實時PCR 儀上進行定量反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）測定，以確定miR-497 的表達水平。

1.2.3 細胞增殖與克隆形成

用不同濃度的miR-497 模擬物轉(zhuǎn)染到前列腺癌細胞系中，轉(zhuǎn)染48 h 后，將miR-497 模擬物的細胞用胰蛋白酶消化并計數(shù)，將3 000 個細胞接種于96 孔板的各孔中，設置3 個復孔，在37 ℃下孵育72 h。孵育結(jié)束后，加入噻唑藍檢測細胞增殖，然后在490 nm 處測量每個樣品的吸光度值。將細胞以每孔1×104個細胞的密度接種在24 孔板中，分別在24、48 和72 h 測定活細胞數(shù)，然后繪制生長曲線。

使用miRNA-497 模擬物或miR-NC 轉(zhuǎn)染后48 h的PC3-AR 細胞進行克隆形成測定。將細胞鋪板并在 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 14 d；培養(yǎng)結(jié)束時，細胞用0.1%結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下計數(shù)。

1.2.4 細胞遷移和侵襲檢測

用Transwell 小室測定細胞遷移和侵襲。在測定細胞侵襲時，Transwell 小室用 40 μl 1 mg/ml 的Matrigel 預包被，將所用細胞饑餓過夜，然后在200 μl 含有 1%FBS 的培養(yǎng)基中以 5×104個細胞的密度接種在上室中。將含有2%FBS（1 ml）的培養(yǎng)基500 μl 加入下室中。將 Transwell 小室在 37 ℃下孵育48 h；孵育結(jié)束后，使用棉簽去除上室中的非遷移/非侵入細胞，然后將遷移/侵入細胞固定在100%甲醇中，并用結(jié)晶紫溶液（0.5%結(jié)晶紫）染色。用顯微鏡觀察并隨機拍攝，遷移/侵襲細胞數(shù)用5 個視野中的平均細胞數(shù)表示。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測細胞凋亡。取2.0 μg/ml 的奧沙利鉑處理的PC3-AR 細胞，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 2 次，用結(jié)合緩沖液 500 μl 重懸細胞，分別加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl 碘化丙啶染液（propidium iodide，PI）（20 mg/ml），混勻，室溫避光靜置15 min，每個樣品重復3 次。細胞凋亡率采用流式細胞儀分析測定，表達式為

細胞的總凋亡率（%）=早期凋亡率（Annexin V+/PI－）＋晚期凋亡率（Annexin V+/PI＋）

1.2.6 免疫印跡分析方法

轉(zhuǎn)染后48 h，使用細胞裂解液將細胞在4 ℃裂解30 min，提取總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后將蛋白膜用含有5%脫脂牛奶的Tris 緩沖液封閉。分別用抗IKKβ（1∶1 000）、抗 CDK8（1∶1 000）、抗 MMP-9（1∶1 000）、抗 PSA（1∶1 000）和抗 β-actin（1∶1 000）抗體在 4 ℃孵育過夜，加入相應二抗一起孵育1 h。用電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色試劑盒檢測蛋白條帶，并用凝膠成像儀拍照。

1.2.7 雙報告基因檢測

PC3-AR 細胞在24 孔板中達60%～70%時，使用Lipofectamine 2000 將100 ng 螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒與50 ng Renilla 質(zhì)粒和650 ng miR-497 模擬物或陰性對照（negative control，NC）共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)雙報告基因檢測試劑盒說明書，使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)測量熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均值±標準差（Mean±SD）表示，組間分析采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-497 在前列腺癌細胞系PC3-AR 中的表達

基于RT-PCR 的miRNA-497 表達結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，與正常的前列腺上皮細胞系RWPE-1 相比，miRNA-497 在前列腺癌細胞系PC3-AR 中的表達水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示miR-497 的異常表達可能參與PCa 的發(fā)生和發(fā)展。

2.2 miRNA-497 對 PC3-AR 增殖的影響

為了探索miR-497 在前列腺癌細胞中的潛在作用機制，分析了miR-497 過表達對PC3-AR 細胞增殖能力的影響。將不同濃度（25、50 和100 nmol/L）的miR-497 模擬物或陰性對照（miR-NC）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到前列腺癌細胞系中，通過噻唑藍檢測miR-497的過表達對前列腺癌細胞增殖影響。結(jié)果顯示，miR-497 以劑量依賴形式顯著抑制PC3-AR 細胞的增殖（表1）?？寺⌒纬傻慕Y(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒miR-NC 細胞相比，miR-497 過表達的 PC3-AR 細胞克隆數(shù)顯著減少（P＜0.01）。此外，觀察到 miR-497 以時間依賴方式顯著抑制PC3-AR 的生長（圖2）。以上結(jié)果表明，miR-497 可顯著抑制前列腺癌細胞的增殖。

2.3 miR-497 對PC3-AR 細胞遷移和侵襲的影響

用 Transwell 法測定的 miR-497 對 PC3-AR 細胞的遷移和侵襲潛力的影響結(jié)果，如圖3 所示。無基質(zhì)膠的Transwell 結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-497 模擬物組的PC3-AR 細胞遷移能力降低，miR-497 過表達顯著抑制了PC3-AR 細胞的遷移。有基質(zhì)膠的Transwell 結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-497 的過表達使PC3-AR 細胞的侵襲能力降低。以上結(jié)果提示miR-497 的過表達可抑制PC3-AR 細胞的遷移和侵襲。

表1 不同濃度miR-497 對前列腺癌細胞活力（%）及克隆數(shù)影響

圖1 miRNA-497 在RWPE-1 和PC3-AR 細胞系中mRNA 的表達水平

圖2 miR-497 對前列腺癌細胞系PC3-AR 生長的抑制作用

2.4 miR-497 的靶基因分析

為了進一步研究miR-497 參與PCa 的機制，通過生物信息學分析鑒定可能的靶標。分析結(jié)果顯示，IKKβ mRNA 的 3'-UTR 中的位置 603～610 可能是miR-497 的結(jié)合位點。為了驗證IKKβ 作為miR-497 的真正靶標，進行雙報告基因檢測miR-497 與IKKβ mRNA 的3'-UTR 的結(jié)合。結(jié)果顯示，用miR-497 和IKKβ 野生型3'-UTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，熒光素酶活性顯著被抑制（P＜0.01，圖 4），而用 IKKβ 突變型（IKKβ 缺失）3'-UTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，熒光素酶活性恢復。上述結(jié)果表明，miR-497 與 IKKβ mRNA 的3'-UTR 中的特定位點結(jié)合。

2.5 miR-497 對細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

為了確定miR-497 是否下調(diào)IKKβ 的內(nèi)源性表達，以及miR-497 在PCa 中的具體機制，通過免疫印跡分析miR-497 模擬物和miR-NC 轉(zhuǎn)染PC3-AR細胞后，細胞中 IKKβ、CDK8、MMP-9 和 PSA 的表達情況。如圖5 所示，過表達miR-497 抑制IKKβ 的蛋白表達，同時CDK8、MMP-9 和PSA 的蛋白水平呈現(xiàn)不同程度的降低，表明miR-497 在PCa 中的腫瘤抑制作用可能通過靶向IKKβ/CDK8/MMP-9 介導。2.6 miR-497 對PC3-AR 細胞的奧沙利鉑敏感性的影響

miR-497 對PC3-AR 細胞的奧沙利鉑敏感性的影響，如圖6、7 所示。與miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-497 模擬物的PC3-AR 細胞的miR-497 表達量顯著升高（圖 6A，P＜0.01）；對于 2.0 μg/ml 奧沙利鉑處理的PC3-AR 細胞，轉(zhuǎn)染miR-497 模擬物后，細胞活力顯著低于 miR-NC 組（圖 6B，P＜0.01）；轉(zhuǎn)染 miR-497模擬物后，2.0 μg/ml 奧沙利鉑處理的PC3-AR 細胞的細胞凋亡率明顯高于miR-NC 組（圖7，P＜0.01）。可見，過表達miR-497 可抑制奧沙利鉑處理的PC3-AR 細胞增殖并促進其凋亡，提升了其對奧沙利鉑的敏感性。

圖3 miR-497 對前列腺癌細胞系PC3-AR 的遷移和侵襲能力的影響

圖4 前列腺癌細胞系PC3-AR 中miR-497 的靶基因分析

3 討論與結(jié)論

循環(huán)miRNA 大量存在于各種體液中，在循環(huán)中的高穩(wěn)定性和可接近性使其有望成為高?；颊?，特別是癌癥早期患者的癥狀性疾病的生物標志物。有研究結(jié)果表明miR-497 在PCa 組織中被下調(diào)[9]。本研究結(jié)果顯示，與正常的前列腺上皮細胞系RWPE-1比較，miRNA-497 在前列腺癌細胞系PC3-AR 中的表達水平顯著下調(diào)。因此，miR-497 可能是PCa 的潛在診斷和預后生物標志物。

圖5 miR-497 對前列腺癌細胞系PC3-AR 細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白的影響

miRNA 家族在基因表達網(wǎng)絡的調(diào)控中起著關鍵作用，進一步參與多種信號通路[10]。miRNA 可以對癌基因或腫瘤抑制基因的表達發(fā)揮正面或負面控制，從而影響腫瘤生長[8]。到目前為止，僅有少量研究涉及miRNA 在PCa 中的作用，并且這些研究中只有少數(shù)成功地確定了在PCa 中特異性調(diào)節(jié)的miRNA 靶標。本研究結(jié)果表明，miR-497 的過表達可抑制CDK8 的表達，從而抑制PC3-AR 細胞增殖。此外，miR-497 過表達可抑制PC3-AR 細胞的遷移和侵襲能力。細胞轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，涉及許多基因和信號通路。揭示miRNA 與靶基因之間關系，對于全面理解miRNA 在癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲中的調(diào)節(jié)機制是重要的。單個miRNA 可以通過靶向具有多種功能的基因來調(diào)節(jié)信號傳導網(wǎng)絡[11]。已有研究結(jié)果證實，miRNA 的具體作用嚴格依賴于其表達模式及其靶向基因[12]。本研究通過生物信息學分析預測并確定IKKβ 是miR-497 的真正靶標。miR-497 通過與IKKβ mRNA 的3'-UTR 中的特定位點結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-497 參與調(diào)節(jié)PCa 中的IKKβ/MMP-9/PSA 信號通路，miR-497 通過靶向 IKKβ 參與 PCa的發(fā)生和進展。

圖6 miR-497 對前列腺癌細胞系PC3-AR 細胞增殖和凋亡的影響

圖7 miR-497 對前列腺癌細胞系PC3-AR 細胞的奧沙利鉑敏感性的影響

奧沙利鉑作為癌癥治療藥物，具有較好的預后效果，但與其他化療藥物相同，使用奧沙利鉑會產(chǎn)生耐藥性[13-14]，目前，關于 miR-497 對 PCa 耐藥敏感性的研究較少。本研究中，通過噻唑藍法分析了miR-497 對PCa 細胞株對奧沙利鉑藥物敏感性的影響，檢測了miR-497 和不同濃度奧沙利鉑處理的PC3-AR 細胞的生存率和凋亡率。研究結(jié)果表明，miR-497 可抑制奧沙利鉑處理的PC3-AR 細胞的增殖并促進其凋亡，可增加其對奧沙利鉑的敏感性。

綜上，miR-497 通過靶向調(diào)節(jié)IKKβ 抑制PCa細胞的增殖，遷移和侵襲。靶向miR-497/IKKβ 相互作用或miR-497 的表達可能是PCa 的預防、診斷和治療的新方法。miR-497 可增加PCa 對奧沙利鉑藥物的敏感性。本研究結(jié)果可為臨床靶向治療PCa 提供新的研究方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突