王瑋尉 梁美霞 許慶文 徐飛鵬 林琳 黃哲 殷靜雯

1廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，湛江524001；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，湛江524001通信作者：殷靜雯，Email：amysays＠live.cn

0 引 言

胃癌是常見的惡性腫瘤，且惡性程度高、早期診斷困難、預(yù)后較差，對人類健康構(gòu)成巨大威脅[1-2]。臨床病理學(xué)分期難以在早期發(fā)現(xiàn)部分高風(fēng)險(xiǎn)的胃癌患者，如一些臨床病理分期較早，但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或發(fā)生異時轉(zhuǎn)移的胃癌患者。目前，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究的深入，已證實(shí)基因的異質(zhì)性對患者預(yù)后有重要影響[3]，為胃癌的診治開辟了新的方向。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）是與胃腸道腫瘤密切相關(guān)的基因[4]。MACC1 高度表達(dá)于結(jié)腸癌和轉(zhuǎn)移灶中[5]。研究結(jié)果表明，MACC1 基因位于罹患胃腸道腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域（7p21.1），在胃腸道及消化系統(tǒng)腫瘤（如胃癌、肝癌、胰腺癌）中高表達(dá)[6-7]。臨床研究結(jié)果表明，MACC1 是決定結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的因子之一，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者在癌癥發(fā)生初期MACC1 的表達(dá)已經(jīng)顯著增高。因此，組織中MACC1 的表達(dá)可能預(yù)示著腫瘤生物學(xué)行為向惡性轉(zhuǎn)變，原發(fā)腫瘤可能會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7-9]。

有研究者指出，胃癌原發(fā)性病灶的MACC1 表達(dá)陽性率明顯高于癌旁黏膜，并與胃癌生存期相關(guān)[10-11]。Shirahata 等[12]發(fā)現(xiàn)MACC1 在發(fā)生腹膜散播轉(zhuǎn)移的胃癌中高表達(dá)。大量研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)MACC1 與胃癌存在相關(guān)性。綜上，MACC1 分子對于腫瘤患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)識別、診斷及預(yù)后預(yù)測都具有臨床應(yīng)用前景。本研究中，通過檢測胃癌組織和血清中MACC1 的表達(dá)，分析血清中MACC1 水平對胃癌的診斷特征，以期為胃癌發(fā)現(xiàn)及診斷提供新的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科于2011年6月至 2020年11月收治的 51 例經(jīng)手術(shù)治療的胃癌患者，其中男性35 例，女性16 例，年齡59.6±11.7 歲。收集患者的血清標(biāo)本、胃癌組織標(biāo)本、癌旁組織標(biāo)本、正常胃黏膜標(biāo)本及相應(yīng)臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者在術(shù)前及術(shù)中均未進(jìn)行化學(xué)治療和放射治療；經(jīng)術(shù)前或術(shù)后病理證實(shí)為胃癌。胃癌的臨床病理分期參照國際抗癌聯(lián)盟的第5 版胃癌TNM（tumor-lymphnode-metastasis）分期法。本研究已經(jīng)過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入患者均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要材料與儀器

MACC1（D-15）抗體（sc-163595，美國 Santa Cruz公司），MACC1 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司），超敏即用型二步法（非生物素）檢測試劑盒（PV-9003，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司），TS100-F相差倒置顯微鏡（日本Nikon 公司），Multiskan MK3酶標(biāo)儀（德國Thermo Scientific 公司）。

1.3 方法

1.3.1 血樣及標(biāo)本采集

用血清分離管收集納入胃癌患者的術(shù)前全血標(biāo)本1 ml。血樣在室溫放置2 h 后，立即用1 000×g離心20 min，取上清放入EP 管，置于-80 ℃保存。于粵西地區(qū)臨床病例資料庫中，取40～70 歲正常人血清標(biāo)本 30 例（男 15 例，女 15 例）作為陰性對照，且使用前置于-80 ℃保存。

收集胃癌患者離體0.5 h 內(nèi)的新鮮胃癌組織標(biāo)本、距癌組織2～2.5 cm 的癌旁組織和距癌組織大于5 cm 的胃癌正常組織。將新鮮組織標(biāo)本立即放入體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液中固定。

1.3.2 雙抗體夾心ELISA 法檢測血清MACC1 表達(dá)

采用雙抗體夾心法檢測血清中MACC1 的表達(dá)。測試前，將ELISA 試劑盒中的所有試劑、血清標(biāo)本緩慢均衡至室溫，所有標(biāo)本均標(biāo)上序號。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品），按濃度高到低加入500 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，依次稀釋成 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)液。稀釋A、B 工作液，分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。標(biāo)準(zhǔn)孔有7 孔，依次加入100 μl 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；空白孔加 100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；分別將100 μl 腫瘤患者血清及陰性對照組血清加入待測樣品孔中。酶標(biāo)板加上覆膜，37 ℃溫育2 h。棄去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌，加B 工作液，棄去孔內(nèi)液體。每孔加底物溶液50 μl，酶標(biāo)板加上覆膜，37 ℃避光顯色25 min。在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下檢測各孔的光密度值。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色

取正常黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織，大小均約 1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，以 1∶10 的體積比置于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛固定液中固定。用梯度乙醇溶液脫水后，用石蠟包埋。在石蠟切片機(jī)上，將組織蠟塊切成4 μm 的薄片，用漂浮法將切片置于干凈的載玻片上，將其放入烤片盒中，于60 ℃恒溫箱內(nèi)烤片25 min。然后用常規(guī)方法進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。

將正常黏膜、癌旁組織、胃癌組織石蠟切片進(jìn)行水化。將切片浸入pH=6.0，0.01 M 的枸櫞酸修復(fù)液中，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 3 次。滴加正常羊血清封閉液50 μl（A 液）封閉。滴加一抗稀釋液（用 PBS 按 1∶50 稀釋）后，4 ℃過夜。滴加辣根過氧化物標(biāo)記山羊抗驢 IgG（B 液）50 μl，37 ℃ 孵育30 min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素（C 液）50 μl。用二氨聯(lián)苯胺（diamio benzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，藍(lán)化，無水乙醇脫水。滴加中性樹脂，封片后用相差倒置顯微鏡觀察并拍照，拍照時保證顯微鏡光源亮度穩(wěn)定、曝光時間一致。

應(yīng)用 Image-Pro Plus（V6.0.0.260）圖像處理分析軟件對胃癌組織免疫組化圖片進(jìn)行定量分析，統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)的累積光密度（integrated optical density，IOD）和平均光密度（mean density）。對細(xì)胞膜、細(xì)胞核、胞漿中的棕色顆粒細(xì)胞進(jìn)行分析，MACC1 蛋白陽性部位主要在胞漿。判斷標(biāo)準(zhǔn)：低倍鏡下選取MACC1 蛋白陽性細(xì)胞最密集區(qū)，再于100 倍鏡下計(jì)數(shù)2～3 個視野中的細(xì)胞，在組織切片中顯示胞漿染色為淡黃色至棕褐色為陽性標(biāo)志，以陽性細(xì)胞占視野中細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)（%）來表示，陽性百分率≥20%為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，三組比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t（least significant difference-t）檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson 相關(guān)性分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線評價(jià)診斷效力，采用約登指數(shù)（即敏感性+特異性-1）評估最佳臨界值。

2 結(jié) 果

2.1 MACC1 在正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織中的表達(dá)

正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織的免疫組化染色圖片如圖1 所示。癌旁組織、胃癌組織的蘇木素-伊紅染色圖片如圖2 所示。MACC1 定位在胞漿。在正常胃黏膜組織中，MACC1 呈陰性表達(dá)或弱陽性表達(dá)，且在弱陽性表達(dá)組織中，陽性瘤細(xì)胞呈不規(guī)則小灶型分布。在癌旁組織中，MACC1 呈陰性表達(dá)或中陽性表達(dá)，且在中陽性表達(dá)組織中，陽性細(xì)胞呈腺管型分布。在胃癌組織中，MACC1 呈中陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞呈彌漫型。

圖1 正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）的免疫組化染色圖片（×400）

圖2 癌旁組織、胃癌組織的蘇木素-伊紅染色圖片（×400）

在所有51 例患者的組織標(biāo)本中：正常胃黏膜組織中10 例MACC1 蛋白陽性表達(dá)，陽性率19.61%；癌旁組織中13 例陽性表達(dá)，陽性率25.49%；胃癌組織中26 例陽性表達(dá)，陽性率50.92%。（表1）

表1 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）在胃癌組織、癌旁組織、正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況

2.2 MACC1 在胃癌患者血清中的表達(dá)

在30 例正常對照中，MACC1 的表達(dá)水平為（0．12±0．08）ng/ml，51 例胃癌患者中，MACC1 的表達(dá)水平為（0．20±0．13）ng/ml，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3．18，P＝0．002）（圖 3）。診斷測試 ROC 曲線表明，血清MACC1 對胃癌具有診斷效力，其曲線下面積（area under curve，AUC） 為 0.717，最佳臨界值為0.38，相應(yīng)的靈敏度為0.55，特異度為0.83（圖4）。

圖3 胃癌患者血清結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）表達(dá)水平

圖4 血清血清結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）對胃癌的診斷測試ROC 曲線

2.3 MACC1 在胃癌組織及血清中表達(dá)的關(guān)系

在胃癌組織MACC1 陰性表達(dá)組中，患者血清MACC1 表達(dá)水平為（0.16±0.12）ng/ml；在胃癌組織MACC1 陽性表達(dá)組中，患者血清MACC1 表達(dá)水平為（0.24±0.13）ng/ml，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.35，P=0.023）。進(jìn)一步結(jié)合分析免疫組化結(jié)果，證實(shí)MACC1 在胃癌患者血清和胃癌組織中表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.52，P＜0.01），如圖 5 所示。

圖5 胃癌患者組織與血清中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）水平的相關(guān)性分析

2.4 胃癌組織及血清MACC1 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4.1 胃癌組織MACC1 低表達(dá)和高表達(dá)組患者的臨床病理參數(shù)分析

對比分析了胃癌組織MACC1 低表達(dá)和高表達(dá)組患者的臨床病理參數(shù)。臨床病理參數(shù)包括：性別（男、女）、年齡（＜55 歲、≥55 歲）、腫瘤發(fā)生部位（賁門底部、胃體部、幽門中部）、病理類型（腺癌、非腺癌）、胃壁浸潤深度（T1～T4）、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（N0～N3）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（是、否）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、腫瘤最大直徑（＜4.5 cm、≥4.5 cm）。結(jié)果表明，胃癌組織MACC1 低表達(dá)和高表達(dá)組在上述病理參數(shù)方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)分別為：性別（χ2=0.49，P=0.49）、年齡（t=0.40，P=0.69）、腫瘤發(fā)生部位（χ2=1.08，P=0.58）、病理類型（χ2=0.27，P=0.61）、胃壁浸潤深度（χ2=0.25，P=0.97）、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=1.21，P=0.75）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（χ2=0.18，P=0.52）、TNM 分期（χ2=1.08，P=0.78）、腫瘤最大直徑（t=0.38，P=0.71）。

2.4.2 胃癌患者血清MACC1 低表達(dá)和高表達(dá)組患者的臨床病理參數(shù)分析

對比分析了胃癌患者血清MACC1 低表達(dá)和高表達(dá)組患者的臨床病理參數(shù)。臨床病理參數(shù)包括：性別（男、女）、年齡（＜60 歲、≥60 歲）、腫瘤發(fā)生部位（賁門底部、胃體部、幽門中部）、病理類型（腺癌、非腺癌）、胃壁浸潤深度（T1～T4）、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（N0～N3）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（是、否）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、腫瘤最大直徑（＜4.5 cm、≥4.5 cm）。

結(jié)果表明，胃癌患者血清MACC1 低表達(dá)和高表達(dá)組在上述病理參數(shù)方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)分別為：性別（t=0.88，P=0.38）、年齡（t=0.43，P=0.67）、腫瘤發(fā)生部位（F=0.45，P=0.64）、腫瘤類型（t=0.65，P=0.52）、胃壁浸潤深度（F=0.74，P=0.54）、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（F=1.15，P=0.34）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（t=1.02，P=0.31）、TNM 分期（F=0.57，P=0.64）、腫瘤最大直徑（t=1.62，P=0.11）。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，胃癌患者的血清MACC1 表達(dá)水平為（0.20±0.13）μg/ml，而正常對照組為（0.12±0.08），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對比癌旁組織和正常組織，胃癌組織中MACC1 表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；胃癌患者血清及胃癌組織中的MACC1表達(dá)水平呈正相關(guān)；胃癌患者M(jìn)ACC1 的表達(dá)水平與其臨床病理參數(shù)（性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小、病理分型、胃壁浸潤深度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM 分期）的關(guān)系均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P ＞0.05）。但胃癌患者血清和胃癌組織中MACC1 呈高表達(dá)，提示MACC1 與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，該結(jié)果與國內(nèi)外其他研究結(jié)果相一致[13-14]。

MACC1 已被證明與腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展高度相關(guān)，并對胃癌患者的臨床結(jié)局產(chǎn)生不利影響。關(guān)于MACC1 在胃癌中的作用機(jī)理，研究結(jié)果表明MACC1 可促進(jìn)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并加速癌癥轉(zhuǎn)移。此外，MACC1 還參與了許多胃癌標(biāo)志物的調(diào)控。MACC1 可能通過與MET 啟動子結(jié)合后增強(qiáng)MET表達(dá)，從而調(diào)控HGF/MET 通路[4]。MET 蛋白是由原癌基因c-met 編碼的人肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的細(xì)胞膜特異性受體。HGF 是肝細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞分泌的多效生長因子。人胃癌細(xì)胞株中HGF 的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞從G0、G1 期進(jìn)入S 期時逐漸增高。HGF 與特異性MET 受體結(jié)合誘導(dǎo)下游信號系統(tǒng)，引起細(xì)胞增殖、黏膜上皮轉(zhuǎn)化，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等。而MACC1 siRNA 能抑制細(xì)胞增殖和移動，減少體內(nèi)轉(zhuǎn)移，并使MET mRNA 和其蛋白的表達(dá)大大減少，抑制細(xì)胞移動和增殖[15]。MACC1 通過調(diào)控TWIST1/2促進(jìn)血管生成，增加腫瘤的血液供應(yīng)[16]。MACC1 還可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子C/D（vascularendothelial growth factor C/D，VEGF-C/D）的細(xì)胞外分泌來促進(jìn)胃癌淋巴管生成，這表明MACC1 可能參與胃癌的淋巴傳播調(diào)控途徑[17]。此外，MACC1 通過增強(qiáng)Warburg效應(yīng)來支持代謝應(yīng)激下的胃癌生長[18]。綜上，MACC1參與胃癌細(xì)胞內(nèi)部和外部的多個生物學(xué)過程，使其成為腫瘤微環(huán)境調(diào)控的重要因子。

本研究中，檢測并對比正常人及胃癌患者血清中的MACC1 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MACC1 水平在胃癌患者血清中明顯增高，這一發(fā)現(xiàn)有助于胃癌的輔助診斷及普查。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者血清及胃癌組織中的MACC1 表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。因此，推測血清中的MACC1 的表達(dá)水平可能與胃癌患者發(fā)病、癌癥的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。血清標(biāo)本易于搜集，因此可能為胃癌患者診斷及預(yù)后判斷提供生物學(xué)參考。血清及胃癌組織的MACC1 表達(dá)與患者的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)無關(guān)，這可能使MACC1 成為獨(dú)立于TNM 的臨床病理分期指標(biāo)及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。因此，對MACC1 的研究能為胃癌的基因治療提供了良好的前景。

綜上所述，MACC1 水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在高相關(guān)性，其可以作為胃癌診斷預(yù)測的參數(shù)，且有望成為胃癌治療的新分子靶標(biāo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突