翁艷潔 周曉水 王常玉 項 濤

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而位居第 3 位，但病死率卻位居各類婦科腫瘤的首位?；熌退?、腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是卵巢癌預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，腫瘤干細(xì)胞在其中起重要作用[1]。卵巢癌也被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞導(dǎo)致的疾病[2]。研究卵巢癌干細(xì)胞具有重要的科研價值和臨床意義[3]。目前卵巢癌干細(xì)胞的識別和分離大多采用腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的方法，例如 CD44、CD133、CD117、CD24、ALDH1或 MyD88等，可能與腫瘤干細(xì)胞的異質(zhì)性有關(guān)[4～8]。卵巢癌中CD90也可能是一種十分重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[9]。筆者將對 CD90 是否可作為卵巢癌干細(xì)胞篩選的分子靶標(biāo)進(jìn)行分析，研究 CD90+卵巢癌細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞的干性特征。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞 SKOV3-MD3 的制備：向5～6周齡雌性裸鼠腿部注射 SKOV3 細(xì)胞1×106/100μl，7天后腹腔注射3mg/kg的順鉑(美國Sigma公司)，每3天1次，共治療8次后處死小鼠，取出瘤塊，消化成單細(xì)胞再次打入其他小鼠腿部，重復(fù)上述實驗 2 次，得到 SKOV3-MD3 順鉑耐藥株。

人卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3 購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。SKOV3及SKOV3-MD3以含10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)于5%CO2、37℃、95% 濕度條件下孵箱中常規(guī)貼壁培養(yǎng)，3～4天傳代1次。

CD90+卵巢癌細(xì)胞用無血清的 DMEM/F12(1∶1)(美國Gibco公司) 培養(yǎng)，其中添加20ng/ml EGF(美國PeproTech公司)、10ng/ml bFGF(美國PeproTech公司)、5μg/ml 胰島素(美國Sigma公司)、B27(1∶50)(美國Invitrogen 公司)、LIF 10ng/ml(美國Millipore公司)。

2.CD90+細(xì)胞和 CD90-細(xì)胞分選：收集貼壁培養(yǎng)的 SKOV3-MD 細(xì)胞，預(yù)冷 PBS 沖洗 2 次后加入 FITC 標(biāo)記鼠抗人 CD90 抗體(美國BD公司)，37 ℃孵育1h。預(yù)冷PBS沖洗2次，采用BD FACSAria Ⅱ流式分選儀對CD90+和 CD90-細(xì)胞進(jìn)行分選。

3.自我更新能力鑒定：體外懸浮球形成能力：分別將上述分選獲得的CD90+和 CD90-兩組細(xì)胞用干細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM/F12(1∶1)(美國Gibco公司) 懸浮培養(yǎng)，其中添加20ng/ml EGF(美國PeproTech公司)、10ng/ml bFGF(美國PeproTech 公司)、5μg/ml胰島素(美國Sigma公司)、B27(1∶50)(美國Invitrogen 公司)、LIF 10ng/ml(美國Millipore公司)進(jìn)行有限稀釋，保證10 個細(xì)胞/毫升的濃度，種入 96 孔低黏附孔板中(每孔200μl)，在顯微鏡下標(biāo)注僅有1個細(xì)胞的孔，共培養(yǎng)14天，比較 CD90+和 CD90-細(xì)胞懸浮球形成的比例以及成球大小。

4.RT-PCR 檢測干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)：分別提取CD90+和CD90-細(xì)胞總 RNA，3μg RNA 合成 cDNA。反應(yīng)條件：95℃ 5min；94℃ 1min；56℃ 30s；72℃ 30s 30個循環(huán),72℃延伸10min。引物：Nestin上游引物：5′-AGCCCAACGTACACCCCGAT-3′，下游引物：5′-CCCCAGAACCCAACTCCTCC-3′；Sox2上游引物：5′-TACCTCTTCCTCCCACTCCA-3′，下游引物：5′-GGTAGTGCTGGGACATGTGA-3′；GAPDH上游引物：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物：5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′。引物均由上海英駿生物有限公司合成。運用Chemi Imager 5500軟件對各條帶進(jìn)行灰度分析, 以各基因和GAPDH積分灰度值的比值作為相對表達(dá)量，比較各基因 mRNA 水平表達(dá)情況。

5.動物成瘤實驗：人卵巢癌非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下移植瘤模型的建立: 每只 NOD/SCID 雌性小鼠(年齡5周)接種的細(xì)胞數(shù)量：CD90+和CD90-細(xì)胞分別為100、1000、10000個/只。每組細(xì)胞用50μl PBS稀釋，與等體積Matrigel混合均勻。在小鼠左側(cè)面淋巴結(jié)處皮下各注射100μl細(xì)胞懸液，次日記為接種第1天。注射后每天換墊料，每周觀察1次腫瘤形成及接種部位有無紅腫、潰破。記錄3個月以內(nèi)的皮下成瘤情況和動物生存狀況。實驗動物由上海市腫瘤研究所實驗病理中心提供。小鼠隨機(jī)分組，每組 6 只小鼠。

結(jié) 果

1.人卵巢癌細(xì)胞SKOV3-MD3中CD90+細(xì)胞比例：流式細(xì)胞儀鑒定人卵巢癌細(xì)胞SKOV3-MD3中CD90+比例為5.3%±0.9%，詳見圖1。

圖1 SKOV3-MD3中CD90+細(xì)胞比例

2.CD90+細(xì)胞自我更新能力高于CD90-細(xì)胞：單個CD90+細(xì)胞有分裂能力，可以在7天形成懸浮克隆球，并且可以連續(xù)傳代3次，說明CD90+細(xì)胞具有自我更新能力。單個 CD90-細(xì)胞增殖能力較慢，14天形成較小的懸浮克隆球，說明有一定的分裂能力。單個CD90+細(xì)胞和 CD90-細(xì)胞懸浮球形成率分別為68.0%±6.3%和18.0%±4.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.22，P<0.01，圖2)。

圖2 單個CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞自我更新能力A.單個CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞懸浮球形成率；B、C分別為單個CD90+ 細(xì)胞和CD90-細(xì)胞體外懸浮球圖片(×200)

3.CD90+細(xì)胞體外分化潛能高于CD90-細(xì)胞：分別將CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞形成的懸浮克隆球細(xì)胞體外培養(yǎng)，用CD90單克隆抗體對細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀再次鑒定兩組懸浮克隆球中CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，單個CD90+細(xì)胞形成的克隆球細(xì)胞中含有CD90+和CD90-兩種細(xì)胞，說明單個CD90+細(xì)胞可以分化形成CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞，具有分化潛能。單個CD90-細(xì)胞形成的克隆球細(xì)胞中只含有CD90-細(xì)胞，無分化潛能，詳見圖3。

圖3 CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞分化潛能鑒定A、C.對照組細(xì)胞；B、D.CD90單抗染色細(xì)胞；A、B.CD90+ 克隆球細(xì)胞；C、D.CD90-克隆球細(xì)胞

4.CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞在 RNA 水平干細(xì)胞標(biāo)志物的相對表達(dá)水平：T-PCR 結(jié)果顯示，在 RNA 水平，CD90+細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物 Nestin和 Sox 2均明顯高于CD90-細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(tNestin=7.12,tSox 2=7.07,P<0.01)，詳見圖4。

圖4 CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞干性標(biāo)志物相對表達(dá)

5.CD90+細(xì)胞在NOD/SCID 小鼠形成皮下移植瘤的能力高于CD90-細(xì)胞：體內(nèi)實驗顯示，CD90+細(xì)胞最低成瘤數(shù)是100個細(xì)胞，成瘤時間是8周。CD90-細(xì)胞組最低成瘤細(xì)胞數(shù) 1×104個細(xì)胞，成瘤時間是8周，詳見表1。CD90+與CD90-細(xì)胞成瘤能力存在明顯的指數(shù)級差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t100=3.26，t1000=6.51，t10000=12.20，P<0.05)。

表1 CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞在NOD/SCID小鼠中皮下成瘤能力

討 論

卵巢癌5年生存率僅30%左右，嚴(yán)重威脅廣大女性的健康[10～12]。卵巢癌中以上皮性癌最多見，而漿液性癌是最常見的上皮性卵巢癌。高級別漿液性腺癌是病死率最高的類型，腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療耐藥是其預(yù)后不良的主要因素。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)也稱為腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cell, TIC)，是腫瘤中具有自我更新和多向分化潛能的一種癌細(xì)胞亞群，與腫瘤的復(fù)發(fā)與耐藥密切相關(guān)。Hamburger 等在 1977 年證實了卵巢癌干細(xì)胞(ovarian cancer stem cells，OCSC)的存在。由于卵巢癌病理類型復(fù)雜，目前分選卵巢癌干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志尚無統(tǒng)一報道，最常見的包括 CD44、CD117、CD133、CD24、ALDH1、MyD88 等。如何識別及獲得卵巢癌干細(xì)胞仍是研究的重點和難點。筆者既往的研究發(fā)現(xiàn)，可通過富集耐藥細(xì)胞群的方式來篩選卵巢癌干細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)化療藥物富集的卵巢癌細(xì)胞SKOV3-MD3較SKOV3細(xì)胞不僅對順鉑的耐藥性增加，還高表達(dá)CD90，提示CD90可能是卵巢癌干細(xì)胞篩選的分子學(xué)標(biāo)志物之一。

CD90是一個25～37 kDa膜表面錨定蛋白，在骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、角化干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞、胃癌干細(xì)胞及腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中均有表達(dá)[13～18]。有研究報道證實，CD90+SKOV3卵巢癌細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog及Oct4表達(dá)水平均明顯高于CD90-細(xì)胞；CD90+細(xì)胞能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞腹腔播散[5，6]。有研究報道，CD90+SKOV3細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog 及Oct4 均明顯高于CD90-SKOV3細(xì)胞[10,11]。但CD90是否可以作為卵巢癌干細(xì)胞篩選的分子學(xué)標(biāo)志物仍需要進(jìn)一步提供理論證據(jù)。為了更好地獲得卵巢癌干細(xì)胞，本實驗室通過順鉑藥物動物體內(nèi)富集的方法獲得了人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株 SKOV3-MD3。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，單個CD90+SKOV3-MD3卵巢癌細(xì)胞在體外培養(yǎng)7天可以形成克隆球，且可以連續(xù)傳代3次，說明CD90+卵巢癌細(xì)胞具有自我更新能力；將單個CD90+形成的克隆球細(xì)胞分析后發(fā)現(xiàn)，單個CD90+卵巢癌細(xì)胞可以再次分化出CD90+和CD90-細(xì)胞，說明 CD90+細(xì)胞具有分化能力，而CD90-卵巢癌細(xì)胞沒有分化能力；CD90+卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog、Oct4、Nestin和Sox。在NOD/SCID小鼠皮下移植瘤實驗中，100個CD90+卵巢癌SKOV3-MD3可以在 8 周形成腫瘤，表現(xiàn)出較高的體內(nèi)成瘤能力；10000個CD90-SKOV3-MD3 細(xì)胞只有1只小鼠可以皮下成瘤。動物實驗結(jié)果提示，CD90+卵巢癌細(xì)胞與CD90-卵巢癌細(xì)胞在成瘤能力中具有顯著的指數(shù)級差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。綜合上述所有結(jié)果可知，CD90+卵巢癌細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，CD90可能是卵巢癌干細(xì)胞的分子學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，通過分析CD90+卵巢癌細(xì)胞的干性特征，不僅進(jìn)一步證實了 CD90在分選卵巢癌干細(xì)胞中的可行性以及卵巢癌干細(xì)胞的異質(zhì)性，還有利于深入研究卵巢癌的分子分型及卵巢癌細(xì)胞的耐藥性及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特性[19]，對于揭示卵巢癌的耐藥機(jī)制，尋找新的分子干預(yù)靶點具有十分重要的研究價值。