蔣朋朋 趙向榮 柯小寧

宮頸癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，2018年全球估計(jì)有311365人因?qū)m頸癌而致死，其中大概90%發(fā)生于發(fā)展中國家[1]。而宮頸病變是正常宮頸上皮發(fā)展至宮頸癌的重要中間階段，其分級診斷在臨床上較為困難。因此常需要借助分子生物學(xué)標(biāo)志物輔助診斷，提高宮頸病變診斷的準(zhǔn)確性[2]。Ki-67主要表達(dá)于增殖細(xì)胞的細(xì)胞核中，是評估細(xì)胞增殖的較好指標(biāo)，常用于宮頸病變的分級診斷[3]。TopoⅡα是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的一種，能調(diào)節(jié)核酸結(jié)構(gòu),是DNA進(jìn)行復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的重要核酶[4]。目前TopoⅡα研究熱點(diǎn)主要在于其可作為蒽環(huán)類藥物的靶酶，常用于腫瘤耐藥時(shí)預(yù)測蒽環(huán)藥物化療的敏感度[5]。但TopoⅡα的表達(dá)在細(xì)胞增殖和分裂中起著重要的作用，其蛋白水平的過表達(dá)反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，也是一個(gè)特殊的細(xì)胞增殖標(biāo)志物[6]。本研究通過免疫組化法研究Ki-67、TopoⅡα這兩種細(xì)胞增殖標(biāo)志物在宮頸病變組織中的不同表達(dá)情況并作比較，同時(shí)探討其在檢出宮頸高級別病變方面的價(jià)值。

材料與方法

1.一般資料：選取2018年1月～2019年1月因?qū)m頸病變就診于邯鄲市中心醫(yī)院門診或住院部，進(jìn)行宮頸活檢或錐切的患者113例，作為觀察組。其中CINⅠ46例、CINⅡ33例、CINⅢ34例。同時(shí)隨機(jī)選取同一時(shí)段因子宮良性病變行手術(shù)治療，病理診斷為宮頸正常組織者45例，作為對照組。入選患者年齡為35～65歲，平均年齡46.0±8.3歲，各組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn)：①35歲≤年齡≤65歲；②此前未接受過放化療或分子靶向治療；③臨床、病理資料完整；④既往無宮頸癌及其他惡性腫瘤病史；⑤兩名高年資病理醫(yī)生復(fù)核診斷的病理分級結(jié)果一致。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<35歲或>65歲；②經(jīng)期、孕期、哺乳期的女性；③臨床、病理資料不完整；④有腫瘤相關(guān)的放化療或其他基因靶向治療史；⑤合并有重要臟器功能損傷；⑥兩名病理醫(yī)生的復(fù)核診斷結(jié)果不一致。本研究開始前均獲得患者或家屬的知情同意。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

2.研究方法：(1)試劑選擇：所有符合條件的標(biāo)本均已使用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。選取符合標(biāo)準(zhǔn)的組織，對其蠟塊進(jìn)行4μm厚連續(xù)切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法染色，DAB顯色，最后結(jié)果使用光鏡進(jìn)行觀察。Ki-67兔抗人型單克隆抗體、鼠抗人型單克隆ToPoⅡα抗體購自上海信裕生物科技有限公司，免疫組化相關(guān)試劑購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。(2)免疫組化步驟:常規(guī)石蠟切片，做好標(biāo)記，68℃烤箱烤片2h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水, 采用高壓鍋高溫修復(fù)抗原，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，每張切片上滴加適量一抗，4℃恒溫過夜，再加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置1h，DAB顯色，蘇木精溶液復(fù)染，標(biāo)本脫水、透明，干燥后中性樹膠封片[7]。每步均經(jīng)準(zhǔn)確的時(shí)間及恰當(dāng)?shù)臏囟确跤褂肞BS緩沖液進(jìn)行沖洗。陰性對照選擇PBS染色替代一抗，陽性對照以宮頸癌染色結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。

3.結(jié)果判讀:Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達(dá)均為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒。在低倍光鏡下觀察，選擇5個(gè)陽性病變典型的區(qū)域，再在高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取5個(gè)陽性細(xì)胞比例的均值確定最終陽性細(xì)胞比例。結(jié)果分為陰性(-):陽性細(xì)胞比例≤5%；弱陽性(+): 6%<陽性細(xì)胞比例≤25%; 中度陽性(++):25%<陽性細(xì)胞比例≤50%；強(qiáng)陽性(+++):陽性細(xì)胞比例>50%。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，期望計(jì)數(shù)<5時(shí)使用連續(xù)校正法或Fisher精確概率法計(jì)算。Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達(dá)與宮頸病變程度的一致性采用Spearman等級相關(guān)性分析。Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL的敏感度、特異性、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值的比較采用配對χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Ki-67、ToPoⅡα在各組中陽性表達(dá)率的比較：Ki-67在對照組、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組中的陽性表達(dá)率逐漸升高，分別為15.56%、45.65%、69.70%和94.12%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.03，P<0.05)。ToPoⅡα在各組中的陽性表達(dá)率依次為11.11%、34.78%、54.55%、88.24%和96.67%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=57.97，P<0.05)，詳見表1、圖1。

表1 各組中Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達(dá)情況[n(%)]

圖1 各組中Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達(dá)情況(免疫組化，×200)

2.Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達(dá)率與宮頸病變級別相關(guān)性比較：Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達(dá)水平均與宮頸病變嚴(yán)重程度具有一致性，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.670和0.647。即宮頸病變的級別越嚴(yán)重，Ki-67、ToPoⅡα的陽性表達(dá)率越高。兩者均能反映宮頸病變的嚴(yán)重程度，一致性相當(dāng)(P=0.000)。

3.Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL的診斷價(jià)值比較：HSIL包括CINⅡ、CINⅢ級病變，Ki-67、ToPoⅡα以檢出CINⅡ及CINⅢ級病變?yōu)殛栃?。陽性檢出情況詳見表2。其中在67例高級別病變組織中，Ki-67陽性例數(shù)55例，ToPoⅡα陽性例數(shù)48例。依據(jù)上述表格分別計(jì)算出Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL敏感度、特異性、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，詳見表3。Ki-67的敏感度、陰性預(yù)測值略高于ToPoⅡα，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ToPoⅡα的準(zhǔn)確率及陽性預(yù)測值略高于Ki-67，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而ToPoⅡα的診斷特異性高于Ki-67，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即在敏感度、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等方面，Ki-67與ToPoⅡα的診斷價(jià)值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是在特異性方面，ToPoⅡα的診斷價(jià)值略高于Ki-67，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 Ki-67、ToPoⅡα檢出HSIL的陽性例數(shù)(n)

表3 Ki-67、ToPoⅡα的檢出HSIL的診斷效能比較[n/n(%)]

討 論

近年來，通過各種分子標(biāo)志物協(xié)助腫瘤的診斷或分級成為各種腫瘤的研究熱點(diǎn)。宮頸癌是一種女性常見的惡性腫瘤，而惡性腫瘤的特征是在細(xì)胞遺傳過程中細(xì)胞分裂增強(qiáng)和無限制的分裂。在反映細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原中，應(yīng)用最為廣泛的是Ki-67。長期以來，關(guān)于ToPoⅡα的研究主要在腫瘤化療的耐藥性或者療效的評估方面[8]。但有研究發(fā)現(xiàn)，ToPoⅡα的表達(dá)與Ki-67具有相關(guān)性，也可以反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)[9]。研究顯示，在臨床治療及判斷預(yù)后等方面ToPoⅡα比Ki-67更具有特異性[10]。本研究旨在比較Ki-67、ToPoⅡα在各宮頸組織中的不同表達(dá)水平，探討其對宮頸高級別病變的檢出效能。

Ki-67主要表達(dá)于增殖細(xì)胞的細(xì)胞核中,而在靜止期細(xì)胞不表達(dá),是評估細(xì)胞增殖的較好指標(biāo)[11]。Ki-67位于人類第10號染色體長臂，由兩條多肽鏈組成，其中一條為345kDa，另一條為395kDa[12]。它能夠識別細(xì)胞周期中核抗原上的一個(gè)抗原決定簇,在增殖細(xì)胞的G1、S、G2期表達(dá),G0期不表達(dá)，與細(xì)胞的合成代謝有關(guān)[3]。Ki-67在細(xì)胞周期不斷的增殖過程中受協(xié)調(diào)機(jī)制控制，若調(diào)控機(jī)制發(fā)生異常，則機(jī)體表達(dá)呈現(xiàn)出增殖紊亂的狀態(tài)。因此Ki-67的高表達(dá)常表示細(xì)胞增殖活躍，可反映宮頸癌或者癌前病變[13]。盡管Ki-67已被用作細(xì)胞增殖的標(biāo)志物和CIN分級的輔助物，但其參與的具體過程仍不明確[14]。

ToPoⅡα表達(dá)于細(xì)胞核,能調(diào)節(jié)核酸結(jié)構(gòu),是控制核酸生物功能的關(guān)鍵酶[15]。其可催化DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)制，屬于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的一種。眾所周知，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是腫瘤細(xì)胞過度增殖造成的，而腫瘤細(xì)胞過度增生，必然涉及到DNA復(fù)制增加和DNA損傷修復(fù)功能增加。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是真核生物細(xì)胞調(diào)控過程中一種必不可少的核酶，可催化DNA鏈的斷裂和再結(jié)合，從而控制DNA的拓?fù)淇臻g狀態(tài)，在調(diào)節(jié)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)過程中發(fā)揮著重要作用[16]。當(dāng)拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)生突變或缺失時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致基因的復(fù)制、染色體分離等缺陷，可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的發(fā)生[17]。因此，ToPoⅡα在惡性腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)不僅反映了增殖活性的增強(qiáng)，還反映了質(zhì)的改變，常提示病變比較嚴(yán)重[18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ki-67在對照組中的陽性表達(dá)主要在基底層及副基底層，隨著病變級別加重，Ki-67的表達(dá)層次逐漸由上皮下1/3層發(fā)展至上皮下2/3層及全層，陽性部位也由局灶陽性向彌漫陽性轉(zhuǎn)變，這與施絨賢等[19]研究結(jié)果一致。同樣，ToPoⅡα的陽性表達(dá)水平也隨著宮頸病變的升級，表達(dá)越來越強(qiáng)。并且，在檢出宮頸高級別病變方面，ToPoⅡα與Ki-67的敏感度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但特異性較Ki-67高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即在腫瘤細(xì)胞增殖方面ToPoⅡα的特異性優(yōu)于Ki-67。但是由于本研究屬于小樣本研究，有待于擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步分析探討TopoⅡα與Ki-67在檢出宮頸高級別病變的效能比較。

綜上所述，TopoⅡα與Ki-67均可反映宮頸病變的級別，且呈正相關(guān)。但在檢出宮頸HSIL方面，TopoⅡα的特異性高于Ki-67，在臨床診斷上具有一定的指導(dǎo)意義。