趙本南，劉大鳳，杜清，陳紅，劉亞玲，王玥蓮，李青峰，張仁卿

成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心，四川成都610061

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19；以下簡稱新冠肺炎）由一種新的冠狀病毒引起，國際病毒分類學(xué)委員會對其進(jìn)行基因組測序后命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）［1］。SARS-CoV-2 導(dǎo)致的新冠肺炎傳染性強(qiáng)，人群易感，但患者普遍預(yù)后良好［2］。為加強(qiáng)新冠肺炎患者管理，《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［3］建議新冠肺炎患者在出院后第2、4 周分別到定點醫(yī)療機(jī)構(gòu)復(fù)診。我們發(fā)現(xiàn)，與治愈出院時比較，普通型新冠肺炎患者治愈1 個月時外周血CD4+T 細(xì) 胞、CD8+T 細(xì) 胞 計數(shù) 沒有 變化［4］。 感染SARS-CoV-2 是否會對患者細(xì)胞免疫功能造成長期的影響是目前研究熱點，我們對39例康復(fù)期新冠肺炎患者外周血淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行動態(tài)隨訪觀察，旨在了解新冠肺炎患者治愈后的細(xì)胞免疫功能變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 截至2020年8月，選擇在成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心治愈出院且在各研究時間點（治愈1、2、3個月）均到我院隨訪的新冠肺炎患者39例，年齡28～81 歲。依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［3］進(jìn)行臨床分型，其中輕型、普通型患者（輕癥）26 例，重型、危重型患者（重癥）13例。輕癥新冠肺炎患者中，男11 例、女15 例，年齡（47.92± 12.79）歲，7 例（26.9%）伴有基礎(chǔ)疾病，住院時間［13.0（8.0，20.2）］天；重癥患者中，男9 例、女 4 例，年齡（56.15 ± 17.53）歲，5 例（38.5%）伴有基礎(chǔ)疾病，住院時間［20.0（13.5，36.5）］天。重癥患者住院時間長于輕癥患者（Z=-2.241，P=0.025），兩者年齡、性別比例、基礎(chǔ)疾病占比等臨床資料具有可比性。39 例患者均經(jīng)嚴(yán)格隔離及有效治療達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)后出院。納入標(biāo)準(zhǔn)：①國內(nèi)感染患病者；②年齡≥16 歲者；③檢查、資料齊全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①國外輸入病例；②妊娠者；③伴有自身免疫性疾病或長期使用激素等免疫抑制藥物者；④腫瘤患者。隨機(jī)選取30 例我院感染科健康職工作為健康對照，其中男10 例、女20 例，年齡（40.17 ± 12.23）歲。本研究在中國臨床試驗注冊中心的注冊號為ChiCTR2000034563，經(jīng)成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：PJ-K2020-06-01），所有新冠肺炎復(fù)診患者簽署知情同意書，符合國家規(guī)定及《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測 分別于入院時、出院時（治愈）及治愈1、2、3 個月（各時間點前后 ± 7 d）時，抽取患者外周靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，采用貝克曼DXFLEX流式細(xì)胞計數(shù)儀及配套試劑盒檢測淋巴細(xì)胞亞群［CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T、B（CD19+）細(xì)胞及NK（CD56+）細(xì)胞］，CD4+T計數(shù)正常值414～1 123/μL，CD8+T 計數(shù)正常值 238～874/μL。入院、出院結(jié)果取距離入院及出院當(dāng)天最近的1 次檢查結(jié)果。對照組收集2019 年體檢時外周血T 淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；輕癥及重癥新冠肺炎患者不同時間點測量的計量資料采用一般線性模型的Repeated Measures過程實現(xiàn)兩因素重復(fù)測量資料的方差分析進(jìn)行比較，并用Multivariate 過程實現(xiàn)不同分型患者在同一時間點的比較，同一分型患者在不同時間點的差異做配對t檢驗進(jìn)行兩兩時間點精細(xì)比較；非正態(tài)分布的計量資料在進(jìn)行重復(fù)測量資料的方差分析前經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布的計量資料后再進(jìn)行統(tǒng)計分析；計數(shù)資料以%表示，組間比較用Fisher 確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點新冠肺炎患者外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)比較 輕癥患者入院時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［450.0（309.2，613.8）］、［253.5（180.8，363.2）］/μL；治愈出院時外周血 CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［400.0（343.0，491.0）］、［299.0（205.0，357.0）］/μL；治愈1 個月時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［418.0（316.0，484.5）］、［268.5（155.0，378.5）］/μL；治愈2 個月時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［458.5（358.5，558.0）］、［336.0（281.8，409.0）］/μL；治愈3 個月時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［562.5（456.0，703.2）］、［390.0（325.0，667.0）］/μL。與入院時、治愈出院時及治愈1 個月時比較，治愈2 個月時輕癥患者外周血CD4+T 計數(shù)及 CD8+T 計數(shù)高（P均＜0.05）；與治愈 2個月時比較，治愈3 個月時輕癥患者外周血CD4+T計數(shù)及CD8+T計數(shù)高（P均＜0.05）。

重癥患者入院時外周血CD4+T、CD8+T計數(shù)分別為［189.0（135.5，365.0）］、［143.0（96.0，229.0）］/μL；治愈出院時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［319.0（228.5，416.5）］、［236.0（151.5，373.5）］/μL；治愈1 個月時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［334.0（235.0，589.5）］、［348.0（160.0，418.0）］/μL；治愈 2 個月時外周血 CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［335.0（277.5，551.5）］、［324.0（197.5，515.5）］/μL；治愈 3 個月時外周血 CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［559.0（326.5，669.5）］、［588.0（284.5，705.0）］/μL。重癥患者入院時外周血CD4+T計數(shù)及CD8+T計數(shù)均較其它時間點低（P均＜0.05）；與入院時、治愈出院時、治愈1 個月時及治愈2 個月時比較，重癥患者治愈3個月時外周血CD4+T計數(shù)、CD8+T計數(shù)高（P均＜0.05）。

與輕癥患者比較，重癥患者入院時外周血CD4+T 計數(shù)、CD8+T 計數(shù)低，治愈出院時外周血CD4+T 計數(shù)低（P均＜0.05），兩者治愈1 個月時、治愈2 個月時、治愈3 個月時外周血CD4+T 計數(shù)及CD8+T計數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.2 不同時間點新冠肺炎患者外周血B 細(xì)胞及NK細(xì)胞計數(shù)比較 因多數(shù)患者入院時未查外周血B細(xì)胞及NK 細(xì)胞計數(shù)，故從治愈出院時作為第1個時間點統(tǒng)計比較。輕癥患者出院時外周血B 細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)分別為［98.0（49.0，143.0）］、［130.0（83.0，212.0）］/μL；治愈 1 個月時外周血B 細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)分別為［103.0（70.0，139.5）］、［112.5（71.8，161.5）］/μL；治愈2 個月時外周血B細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)分別為［119.0（87.2，159.0）］、［128.0（85.5，214.2）］/μL；治愈3 個月時外周血B 細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)分別為［181.5（115.5，231.0）］、［175.0（108.2，310.2）］/μL。與入院時、治愈出院時、治愈1 個月時及治愈2 個月時比較，治愈3個月時輕癥患者外周血B細(xì)胞計數(shù)、NK細(xì)胞計數(shù)升高（P均＜0.05）。

重癥患者治愈出院時B 細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)分 別 為［53.0（43.0，101.0）］、［135.0（120.0，176.5）］/μL；治愈 1 個月時外周血B 細(xì)胞計數(shù)、NK細(xì)胞計數(shù)分別為［82.0（58.5，121.5）］、［125.0（89.0，197.5）］/μL；治愈2 個月時外周血B 細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)分別為［95.0（68.0，168.5）］、［175.0（109.0，218.5）］/μL；治愈3 個月時外周血B細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)分別為［129.0（96.5，191.5）］、［240.0（139.5，336.0）］/μL。與入院時、治愈出院、治愈1 個月時及治愈2 個月時比較，治愈3 個月時重癥患者外周血B 細(xì)胞計數(shù)、NK 細(xì)胞計數(shù)均高（P均＜0.05）。

輕癥患者與重癥患者在入院時、治愈出院時、治愈1個月時、治愈2個月時、治愈3個月時的外周血B細(xì)胞計數(shù)及NK 細(xì)胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.3 新冠肺炎與健康對照者外周血CD4+T、CD8+T計數(shù)及CD4+T/CD8+T 比較 39 例患者入院時外周血CD4+T、CD8+T計數(shù)降低者分別為24、21例；治愈1個月時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)降低分別為18、14例，治愈2 個月時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)降低者分別為 15、9 例，治愈 3 個月時外周血 CD4+T、CD8+T計數(shù)降低者分別為4、3例。

健康對照者外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［634.0（488.8，861.3）］、［516.5（332.8，861.3）］/μL，CD4+T/CD8+T 為 1.35（0.90，1.85）。新冠肺炎患者入院時外周血CD4+T、CD8+T計數(shù)分別為［355.0（188.0，523.0）］、［216.0（120.0，324.0）］/μL；治愈出院時外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［390.0（316.5，480.0）］、［292.0（200.0，357.0）］/μL；治愈1 個月時外周血 CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［403.0（259.0，486.0）］、［269.0（156.0，383.0）］/μL；治愈2 個月時外周血 CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［440.0（335.0，552.0）］、［327.0（273.0，425.0）］/μL；治愈3 個月時外周血 CD4+T、CD8+T 計數(shù)分別為［559.0（451.0，685.0）］、［427.0（322.0，666.0）］/μL、CD4+T/CD8+T 為1.30（0.97，1.64）。與健康對照者比較，新冠肺炎患者入院時、治愈出院時、治愈1 個月、治愈2 個月時的CD4+T 計數(shù)及CD8+T 計數(shù)均低（P均＜0.05）。治愈3 個月時新冠肺炎患者CD4+T、CD8+T 計數(shù)及 CD4+T/CD8+T 對比健康對照者，P均＞0.05。治愈3 個月時新冠肺炎患者外周血CD4+T、CD8+T計數(shù)的幾何均數(shù)分別為555、448/μL。

3 討論

CD4+T細(xì)胞為主要的輔助性T細(xì)胞，能促進(jìn)B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的增殖、分化［5］；CD8+T 細(xì)胞可對毒性細(xì)胞發(fā)揮抑制作用［6］。研究顯示，機(jī)體感染SARS-CoV-2后會觸發(fā)細(xì)胞因子釋放，推動T細(xì)胞的消耗和衰竭［7］，最終機(jī)體出現(xiàn)免疫系統(tǒng)紊亂［8］。本研究中，入院時分別有61.5%（24/39）、53.8%（21/39）的新冠肺炎患者伴有CD4+T 計數(shù)及CD8+T 計數(shù)低于正常下限，重癥患者外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)低于輕癥患者，提示新冠肺炎患者普遍存在CD4+T、CD8+T 數(shù)量減少，且在重癥患者中下降更為明顯，與王永等［9］、羅高權(quán)等［10］的研究結(jié)果一致。CD4+T 和/或CD8+T 計數(shù)降低可作為患者預(yù)后不良的獨立危險因素［11-12］。本研究顯示，治愈出院后1、2、3 個月時，輕癥患者與重癥患者的CD4+T、CD8+T計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

NK細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，可以直接殺死被感染的細(xì)胞，并有助于適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活和定位［13］；B 細(xì)胞則在CD4+T 細(xì)胞的刺激下異化為漿細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生特異性抗體。NK 細(xì)胞及B 細(xì)胞在機(jī)體感染病毒后控制病毒復(fù)制、清除病毒中起到重要作用。目前，臨床上發(fā)現(xiàn)部分新冠肺炎患者出院后存在SARS-CoV-2核酸“復(fù)陽”現(xiàn)象，核酸“復(fù)陽”普遍發(fā)生在新冠肺炎患者治愈出院后的15 天內(nèi)［14-16］，故有學(xué)者認(rèn)為，患者在康復(fù)早期體內(nèi)仍存在SARS-COV-2殘留，病毒并未被完全清除，甚至可以間斷復(fù)制［17］。這一觀點解釋了本研究中，與治愈出院時比較，新冠肺炎患者在治愈出院1 個月時，CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B 細(xì)胞及NK 細(xì)胞計數(shù)均未升高，仍處于較低水平。治愈2 個月時，輕癥患者外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)較前升高；治愈3 個月時，輕癥及重癥患者的外周血 CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞計數(shù)均較前明顯升高，且多數(shù)患者外周血CD4+T、CD8+T 計數(shù)已在正常范圍。上述結(jié)果提示，隨著治愈時間延長，新冠肺炎患者外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量可能會逐漸升高，免疫系統(tǒng)功能逐漸恢復(fù)。

新冠肺炎患者治愈3 個月時的CD4+T 計數(shù)、CD8+T 計數(shù)及CD4+T/CD8+T 與健康對照者比較，尚不能認(rèn)為兩者的CD4+T 及CD8+T 計數(shù)存在差異。但本研究中健康對照者例數(shù)偏少，能否真實反映四川地區(qū)總體水平未知，故與我國其他省市健康人群的外周血T 淋巴細(xì)胞亞群大數(shù)據(jù)比較可能更有意義。研究［18-20］顯示，我國健康人外周血 CD4+T 細(xì)胞數(shù)量在不同性別、不同年齡間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而CD8+T 細(xì)胞數(shù)量是否受性別及年齡影響結(jié)論不一。本研究中，新冠肺炎患者治愈3個月時外周血CD4+T計數(shù)的幾何均數(shù)為555/μL，遠(yuǎn)低于湖北健康人群的681/μL［20］、上海健康人群的727/μL［19］及天津健康人群的860/μL［18］；CD8+T計數(shù)的幾何均數(shù)為448/μL，低于上海健康人群的540/μL［19］及天津健康人群的672/μL［18］，但與湖北健康人群的 510/μL［20］接近。上述結(jié)果提示，治愈3 個月時新冠肺炎患者外周血CD8+T計數(shù)已接近正常水平，但CD4+T計數(shù)仍偏低。

目前，關(guān)于新冠肺炎患者治愈出院后的長期隨訪報道極少，考慮到SARS-CoV-2 與SARS 冠狀病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）全基因組序列一致性達(dá)79.6%［21］，SARS患者在發(fā)病初期同樣表現(xiàn)出細(xì)胞免疫功能受到明顯損害、T 淋巴細(xì)胞計數(shù)減少［22-24］，康復(fù)期SARS 患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的隨訪結(jié)果對評估新冠肺炎患者細(xì)胞免疫功能的遠(yuǎn)期變化具有一定的參考價值。謝靜等［25］報道，SARS患者的CD4+T 細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞數(shù)量隨著病情好轉(zhuǎn)逐漸升高，與正常對照者比較，在發(fā)病后2～3 月時的CD8+T 細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但CD4+T 細(xì)胞數(shù)量仍低，且在發(fā)病1 年后CD4+T 細(xì)胞數(shù)量仍低于正常對照者。羅宏等［26］報道，部分SARS 患者在治愈出院2 年后，免疫功能仍存在損害，主要表現(xiàn)為CD3+T/CD8+T 值下降甚至倒置。因此，新冠肺炎患者細(xì)胞免疫功能逐漸恢復(fù)至正?？赡苄枰?jīng)歷一個長期過程。

綜上所述，新冠肺炎患者在治愈早期，細(xì)胞免疫功能仍被抑制。隨治愈時間延長，新冠肺炎患者外周血CD4+T、CD8+T、B 細(xì)胞及 NK 細(xì)胞數(shù)量可能會逐漸升高。與我國健康人群比較，治愈3 個月時新冠肺炎患者外周血CD8+T 計數(shù)已接近正常，但CD4+T計數(shù)仍偏低。從治愈出院1 個月起，新冠肺炎輕癥患者與重癥患者的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究納入樣本量較小，觀察時間截至治愈出院后3個月，需要在更大規(guī)模的患者人群中進(jìn)行更長時間的觀察驗證本研究結(jié)果。