楊 苗， 張羽欣， 汪夢雯， 李康杰， 胡 歆， 夏 飛， 秦俊哲*

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.國家林業(yè)和草原局 茯茶工程技術研究中心, 陜西 咸陽 712000)

0 引言

茯磚茶發(fā)源于涇陽，屬于六大茶類中的黑茶[1]，其主要區(qū)別于其他黑茶的特征就是茶磚內(nèi)部長有“金花”，“金花”是由散囊菌屬產(chǎn)生的閉囊殼[2].茯磚茶能夠消食解膩，深受大眾喜愛.古時流傳有“非涇陽之水不能制茯茶”之說.茯磚茶生產(chǎn)的關鍵在于其“發(fā)花”工藝，“金花菌”對于茯磚茶品質(zhì)形成起著至關重要的作用[3-6].“金花菌”能夠降低原料茶的苦澀味，增加其醇和感[7,8]，并且能夠產(chǎn)生水溶性色素以及多種香氣成分[9-12]，以形成茯磚茶獨有的風味，并促進其品質(zhì)的形成.目前研究表明，溫度、濕度是控制“發(fā)花”的最主要因素；但是關于水質(zhì)如何影響“金花菌”的生長，進而影響茯磚茶的品質(zhì)，還尚未有結(jié)論.調(diào)研證實，涇陽地區(qū)地下水以微咸水為主，涇河流域地下水中陽離子濃度最高的為Na+、Ca2+、Mg2+，平均濃度高于黃河及長江等內(nèi)陸河流域及全球河流[13,14]，且生產(chǎn)企業(yè)多以地下水加工茯磚茶.水中的這些離子對“金花菌”生長有何影響，其機制還尚不明確.

為探究“金花菌”對于高滲培養(yǎng)條件的生長適應，本研究從茯磚茶中分離“金花菌”，并采用形態(tài)學結(jié)合分子生物學技術進行鑒定.選擇典型的2株“金花菌”對其在蔗糖和NaCl模擬高滲條件的下的生長特性進行研究.本研究對于揭示“金花菌”適應較高鹽度的生長機制，為進一步明確茯磚茶品質(zhì)形成的作用機理，提高茯磚茶品質(zhì)奠定堅實基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料及菌種

茯磚茶，購自涇陽茯茶鎮(zhèn).

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

蔗糖、葡萄糖、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣，以上試劑均為分析純，購于天津市紅巖化學試劑廠；瓊脂粉、蛋白胨為生化試劑，產(chǎn)自北京奧博星生物技術有限責任公司；真菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司).

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g煮沸過濾去渣， 葡萄糖2 g，瓊脂20 g， 蒸餾水1 000 mL，自然pH.

CZG培養(yǎng)基：蔗糖20 g,氯化鈉23 g,磷酸氫二鉀l g,硝酸氨3 g,硫酸鎂0.5 g,瓊脂20 g.

1.1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器(LS-C50L，江陰濱江醫(yī)療設備廠)；臺式掃描電鏡(Phenomenon Pro，復納科學儀器有限公司)；凝膠成像儀(FR-1000，上海復日科技有限公司)；PCR儀(T100，Bio-Rad)；離心機(TDL-80-2B，上海安亭科學儀器廠)；霉菌培養(yǎng)箱(MJX-150-Ⅱ，北京科偉永興儀器有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 “金花菌”的鑒定

(1)平板形態(tài)觀察

將分離出的“金花菌”單點接種于不同培養(yǎng)基平板，在28 ℃下培養(yǎng)4 d，對其平板單菌落形態(tài)進行觀察.

(2)電鏡下“金花菌”形態(tài)觀察

制樣方法：樣品臺上粘貼導電膠，挑取“金花菌”至導電膠上，室溫下放置24 h，使其干燥后進行觀察.

(3)轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列分析

無菌條件下刮取單菌落菌絲，加入滅菌后的石英砂進行研磨，使用天根試劑盒提取DNA.隨后使用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行ITS序列擴增[15].反應體系包括上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq預混合Mix 12.5μL，DNA模板5μL以及5.5μL超純水.擴增條件為：95 ℃預變性5 min，隨后在94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s之后，進行32個循環(huán)的擴增.循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸7 min[16]，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳確認片段大小后，交由生工生物工程股份有限公司進行測序分析.測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，并采用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，選用Neighbor-Joining繪圖算法，重復迭代1 000次[17].

1.2.2 “金花菌”高滲條件下特性研究

(1)蔗糖含量對“金花菌”生長的影響

以CZG培養(yǎng)基為基礎，分別添加20%、70%蔗糖，觀察蔗糖產(chǎn)生的高滲條件對“金花菌”生長的影響.

(2)鹽離子對“金花菌”生長的影響

以40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎，添加0.5%～22.5%的NaCl，將分離出的“金花菌”接種于各鹽濃度平板上，同時將從茯磚茶分離出的雜菌黑曲霉及青霉接于各鹽濃度平板，觀察其生長情況；以40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎，對比添加CaCl2和MgCl2對“金花菌”生長的影響.

(3)高滲條件對“金花菌”的生殖方式的影響

挑取純化后的“金花菌”菌株，將其單點接于不同培養(yǎng)基平板上，通過插片培養(yǎng)，2 d后開始在顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照.

1.3 統(tǒng)計分析

每個試驗重復3次，方差分析采用LSD法進行計算，結(jié)果以Means±SD表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 “金花菌”平板菌落形態(tài)

從茯磚茶中共分離出21株金花菌，選取2株平板形態(tài)差異較大的“金花菌”F-2和J-2單點接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)4 d.如圖1(a)所示，菌株F-2菌落中心呈深褐色，中心有褐色液滴產(chǎn)生，并且色素滲透至培養(yǎng)基中，菌株外圈菌絲呈白色；菌株J-2菌落呈鵝黃色，菌落外圈白色菌絲生長，該菌株不產(chǎn)生色素(如圖1(b)所示).

(a)菌株F-2 (b)菌株J-2

2.2 “金花菌”的顯微形態(tài)特征

“金花菌”既能夠進行有性生殖也可進行無性生殖.在“金花菌”有性生殖過程產(chǎn)生子囊果(如圖2(a)所示)，子囊果中包含著子囊(如圖2(b)所示)，子囊中內(nèi)含8個子囊孢子(如圖2(c)所示).子囊果外層有著一層外殼包被，在釋放孢子時，外殼破裂，釋放出其中的子囊，子囊在子囊果中有相應的“座位”，排列緊湊，且不形成擠壓，子囊在發(fā)育初始階段外面包被有一層薄膜，待發(fā)育成熟后，逐漸撐破外層薄膜，孢子被釋放出來，孢子的外層呈堅硬狀.

(a)包被完整的子囊果 (b)破裂的子囊果

“金花菌”無性生殖產(chǎn)生分生孢子，分生孢子頭上分生孢子呈串狀排列，分生孢子為中空橢圓形，粗糙具小刺.分生孢子直接裸露在外，外層無包被(如圖3所示).

菌株F-2與J-2的子囊孢子均呈現(xiàn)凸鏡狀，凸面具有小疣或褶皺，并且具有赤道(如圖4(b)、(d)所示).但F-2與J-2的子囊孢子形態(tài)不完全相同，F(xiàn)-2的子囊孢子脊較短，不規(guī)則，且赤道部分較寬，根據(jù)《中國真菌志》及曲霉分類學[18]，認為F-2與Aspergillusintermedius孢子形態(tài)極為相似，F(xiàn)-2可能為A.intermedius.J-2的赤道溝較深，且凸面上形成網(wǎng)結(jié)的肋狀凸起，這與肋狀散囊菌(A.costiforme)的形態(tài)特征相似，且其在PDA、40%蔗糖蛋白胨、40%蔗糖麥芽汁、20%蔗糖CZG及70%蔗糖CZG等多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)均未見到有色素產(chǎn)生，結(jié)合其培養(yǎng)特征[19]，認為J-2與肋狀散囊菌(A.costiforme)具有高度一致性.

(a)分生孢子頭 (b)串狀排列

(a)F-2子囊果(1 450×) (b)F-2子囊孢子(7 700×)

2.3 ITS序列分析

“金花菌”F-2和J-2與Aspergillus的多個菌株具非常高的相似度.通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖5所示)，發(fā)現(xiàn)F-2、J-2與Penicillium(青霉屬)，Talaromyces(籃狀菌屬)等分別屬于兩個簇，與Eurotiummedium,A.intermedius,A.costiformis等9個菌株屬于同一分支中，具有非常高的同源性.

圖5 F-2及J-2的系統(tǒng)發(fā)育分析

“金花菌”是以冠突散囊菌為主的散囊菌屬真菌，散囊菌屬真菌具有高度同源性[20,21]，根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株F-2和J-2與A.intermedius等9株菌高度同源性.由于ITS的分辨率達不到種水平以下的分類[21]，經(jīng)過ITS序列比對只能將兩株“金花菌”鑒定到屬.系統(tǒng)發(fā)育樹中E.medium與A.intermedius屬于同一分支，這是由于以前對于該屬的命名分為有性型和無性型命名，國際青霉菌和曲霉菌委員會(ICPA)為了避免命名混淆，將所有的Eurotium分類群轉(zhuǎn)移到Aspergillus[18]，這種做法也被廣為接受，很多作者傾向于使用Aspergillus[22].

結(jié)合菌株F-2和J-2的形態(tài)特征，F(xiàn)-2極可能為A.intermedius，J-2與肋狀散囊菌(A.costiforme)的形態(tài)特征吻合，具有極高相似度.

2.4 蔗糖模擬高滲條件對“金花菌”生長的影響

兩株“金花菌”在20%蔗糖CZG培養(yǎng)基上，氣生菌絲生長受限，產(chǎn)生較多子囊果，菌絲包裹子囊果在培養(yǎng)基表面形成米褐色小斑狀.隨著培養(yǎng)時間延長，菌落中間的斑點逐漸變大，顏色加深，未見有液體滲出.在此培養(yǎng)基上只進行有性生殖，未見有分生孢子出現(xiàn).F-2在培養(yǎng)初期菌落顏色呈現(xiàn)淺黃色，當培養(yǎng)至6 d時，產(chǎn)生近橄欖褐色色素，滲透到基質(zhì)中(如圖6(a)、(b)所示)；J-2始終未產(chǎn)生色素，反面為黃色.

采用70%蔗糖CZG培養(yǎng)基模擬高滲條件，研究“金花菌”的生長適應特性.兩株“金花菌”在70%蔗糖CZG培養(yǎng)基上較20%蔗糖CZG培養(yǎng)基上約晚24 h萌發(fā).生長初期，無色氣生菌絲生長，產(chǎn)生灰綠色分生孢子頭，隨后，產(chǎn)生黃色閉囊殼，菌落呈現(xiàn)黃色，菌落邊緣仍有灰綠色分生孢子頭.在70%蔗糖CZG平板上存在有性生殖和無性生殖兩種生殖方式.菌株F-2在20%蔗糖CZG平板上產(chǎn)生色素，在70%蔗糖CZG平板上不產(chǎn)生色素；菌株J-2在70%蔗糖CZG也較20%蔗糖CZG平板上顏色更淺(如圖6(c)、(d)所示 ).

(a)20%蔗糖CZG菌落形態(tài) (b)70%蔗糖CZG菌落形態(tài)

“金花菌”在添加高濃度蔗糖的CZG平板上依然能夠生長，而且長勢旺盛，表明其能夠耐受高糖的環(huán)境.有研究者從蔗糖廠的環(huán)境及生產(chǎn)的蔗糖成品中均分離出謝瓦散囊菌(A.chevalieri)，該種真菌能夠耐受高糖條件，成為蔗糖生產(chǎn)過程中的一種主要污染菌[23]，因此“金花菌”在添加70%蔗糖的培養(yǎng)基中仍然能夠生長很好.“金花菌”在大多數(shù)情況下進行有性生殖，但在高糖誘導下產(chǎn)生無性型，主要是由于有性生殖是對營養(yǎng)限制及環(huán)境刺激作出的反應，而在營養(yǎng)豐富的時候會進行無性生殖[24].

2.5 鹽離子對“金花菌”生長的影響

“金花菌”在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天菌落直徑約為3.8 cm.在添加了0.5%～22.5%的NaCl的40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基上，“金花菌”均能夠生長.“金花菌”在NaCl濃度較低的情況下形成較多黃色閉囊殼，菌落中心呈黃色，外部邊緣為白色絨毛狀菌絲，但是隨著NaCl濃度的增大，在萌發(fā)后先產(chǎn)生大量茂盛的白色菌絲體，其菌落呈灰綠色，隨著菌的不斷生長，開始逐漸形成黃色閉囊殼.在添加0.5%～15.5%的NaCl培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，菌落直徑如表1所示.

兩株“金花菌”均在添加4.5% NaCl的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，生長最好，J-2的菌落直徑為4.53 cm，而F-2的菌落直徑達到4.82 cm.隨著培養(yǎng)基中NaCl含量的升高，“金花菌”生長受到抑制，其菌落直徑也隨之減小.雖然高濃度NaCl抑制“金花菌”萌發(fā)，但2株“金花菌”在高糖高鹽培養(yǎng)基上仍能很好生長(如圖7所示).與“金花菌”對比，黑曲霉在添加0.5%～15.5% NaCl的平板上可以生長，但當NaCl添加量達到11.5%時，其生長受到抑制，萌發(fā)時間延長.青霉在含NaCl平板中生長受限，當NaCl含量達到8.5%時，菌株未萌發(fā).

(a)16.5% NaCl F-2形態(tài) (b)16.5% NaCl J-2形態(tài)

“金花菌”能夠耐受一定濃度的CaCl2和MgCl2，Mg2+一定程度上可促進“金花菌”生長，并且其他研究證實，鎂離子能夠促進真菌菌體生長[25].通過對涇陽地表水和地下水中化學成分的分析，Na+和Mg2+為主控陽離子.適量NaCl會促進“金花菌”生長，隨著NaCl含量的增加，會推遲“金花菌”萌發(fā)時間.

表1 不同NaCl濃度40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基上F-2和J-2菌落直徑

將茯磚茶中分離出的黑曲霉、青霉同“金花菌”同時接于不同濃度NaCl含量的平板上，發(fā)現(xiàn)當NaCl含量達到8.5%時，青霉不能生長，而當NaCl濃度達到15.5%時，黑曲霉生長已經(jīng)受到極大抑制，當NaCl含量增至22.5%時，“金花菌”仍然能夠生長.一方面高濃度的NaCl能夠抑制其他雜菌生長，另一方面“金花菌”能夠耐受高濃度NaCl，因此水中高濃度NaCl有利于茯磚茶“發(fā)花”而不受到雜菌污染.

2.6 高滲條件對“金花菌”的生殖方式的影響

“金花菌”在高滲培養(yǎng)基上，氣生菌絲生長茂盛，隨后形成球型頂囊(如圖8(a)所示)，在頂囊上長出單層小梗(如圖8(b)所示)，逐漸發(fā)育，在分生孢子梗上產(chǎn)生分生孢子(如圖8(c)、(d)所示).“金花菌”在70%蔗糖CZG培養(yǎng)基上及在高鹽濃度的40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，開始先進行無性生殖，隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸進行有性生殖.

(a)球型頂囊 (b)頂囊長出單層小梗

“金花菌”在處于脅迫環(huán)境時可以通過選擇生殖方式以適應環(huán)境.“金花菌”常規(guī)培養(yǎng)條件下均進行有性生殖.在高鹽高糖誘導下，“金花菌”改變生殖方式，進行無性生殖，產(chǎn)生分生孢子，無性生殖是一種較低級的生殖方式.通過觀察發(fā)現(xiàn)隨著NaCl含量的升高，“金花菌”產(chǎn)生灰綠色分生孢子頭進行無性生殖.有研究發(fā)現(xiàn)在平板中添加3 M的NaCl會使“金花菌”只進行無性生殖[24]，在本研究中，當NaCl添加量為18.5%時，仍然存在有性和無性兩種生殖方式，可能是由于選用的培養(yǎng)基不同，營養(yǎng)狀態(tài)不一致導致.在極端環(huán)境時，首先菌絲生長進行營養(yǎng)增殖，選擇較為簡單的無性繁殖方式產(chǎn)生分生孢子，隨后再進行有性生殖，產(chǎn)生子囊孢子.“金花菌”主要進行有性生殖，使其能夠耐受逆境.在脅迫環(huán)境下，“金花菌”子囊果、子囊對子囊孢子形成重重保護，使其能夠耐受較高的滲透壓，在條件適宜時又會重新萌發(fā).“金花菌”的子囊孢子結(jié)構(gòu)較分生孢子更穩(wěn)定，分生孢子在外力作用下發(fā)生變形，甚至破裂，而子囊孢子幾乎無變化.“金花菌”不僅存在結(jié)構(gòu)優(yōu)勢能夠適應逆境，同時存在一些抗逆基因，能夠有利于其對抗脅迫，在一些研究中發(fā)現(xiàn)謝瓦散囊菌(A.chevalier)中分離出GDH基因能夠有利于水稻耐干旱脅迫[26].

“金花菌”在茯磚茶的生產(chǎn)過程中是優(yōu)勢菌，具有極強降解能力，但在其他行業(yè)中，如制糖工業(yè)，煙業(yè)中，“金花菌”卻是一種污染菌，通過本研究對“金花菌”對各種離子的耐受以及耐高滲特性的揭示，更有利于“金花菌”在茯磚茶生產(chǎn)中的應用及在其他行業(yè)中的控制，為工業(yè)中有效利用和控制“金花菌”奠定基礎.

3 結(jié)論

茯磚茶中分離出兩株“金花菌”F-2和J-2分別與Aspergillusintermedius和肋狀散囊菌(Aspergilluscostiforme)具有高度相似性.2株“金花菌”能夠在22.5%的NaCl和10.5%的CaCl2和MgCl2培養(yǎng)基上能夠生長，且MgCl2的添加對“金花菌”的生長具有明顯促進作用.“金花菌”能夠耐受70%蔗糖濃度，在高糖、高鹽模擬的高滲條件下，“金花菌”氣生菌絲生長旺盛，產(chǎn)生灰綠色分生孢子頭，進行無性生殖.“金花菌”極可能通過選擇生殖方式對抗高滲脅迫，其有性生殖產(chǎn)生的子囊果結(jié)構(gòu)更能抵抗不利環(huán)境.