楊 輝， 王婷婷， 趙 敏， 蘇 文， 董騰達(dá)， 黃莎莎

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

海紅果為府谷縣地理標(biāo)志保護(hù)性水果，顏色呈鮮紅色有輕微的澀味.主要分布在陜西、山西、內(nèi)蒙古三省相鄰地帶，研究表明海紅果具有一定的營養(yǎng)價值，其中包含豐富的礦物質(zhì)、有機鈣、多酚類、黃酮類物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)常食用具有抗衰老、預(yù)防心腦血管老化 、抑制脂肪堆積、減肥和防高血脂癥等功效[1,2].海紅果含糖18%左右，酸含量約11 g/L，是釀果酒的極好原料.

隨著人們飲酒安全和健康意識的不斷提高，即“高度酒向低度酒轉(zhuǎn)變，蒸餾酒向釀造酒轉(zhuǎn)變，糧食酒向水果酒轉(zhuǎn)變”的飲酒三個轉(zhuǎn)變更加深入人心[3].低度果酒不僅避免了酒精含量的過多攝入帶來的危害，還滿足了消費者對健康和營養(yǎng)的需求，因此，低度果酒深受消費者的喜愛.

市售海紅果酒多由釀酒酵母發(fā)酵，雖然釀酒酵母具有耐高溫，耐酒精的優(yōu)點；但是果酒口感寡淡，香味不足，且采用釀酒酵母釀造低度酒，想要達(dá)到理想的低酒精度時，終止困難，從而影響了海紅果酒的多樣性[4].研究發(fā)現(xiàn)部分非釀酒酵母在發(fā)酵果酒時，可以降低果酒中的酒精含量，改善果酒的口感，豐富酒中的風(fēng)味物質(zhì)[5-8].非釀酒酵母主要包括檸檬形克勒克酵母、有孢漢生酵母和東方伊薩酵母等.其中，檸檬形克勒克酵母能形成更多的酯類物質(zhì)，如帶有香蕉味的乙酸異戊酯和帶有玫瑰花香的乙酸苯乙酯[9-11]；檸檬形克勒克酵母和有孢漢生酵母易產(chǎn)生果膠酶，糖苷酶，蛋白酶等，產(chǎn)生的果膠酶可使果酒變澄清，β-葡萄糖苷酶可以提升酒中的香氣[12-14]；東方伊薩酵母和有孢漢遜酵母能產(chǎn)生更多的高級醇等物質(zhì)[15,16].因此將非釀酒酵母應(yīng)用于海紅果酒的釀造中，可以釀造出低酒精度、高品質(zhì)、風(fēng)格獨特的果酒.

本實驗選用兩種不同類型的非釀酒酵母：檸檬形克勒克酵母和東方伊薩酵母，分別發(fā)酵海紅果酒.在兩種非釀酒酵母耐受性的研究基礎(chǔ)上，對兩種非釀酒酵母發(fā)酵海紅果酒的發(fā)酵特性進(jìn)行研究，為非釀酒酵母應(yīng)用于海紅果酒奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

東方伊薩酵母1344(Issatchenkiaorientalis)、檸檬形克勒克酵母31232(klockeraapiculata)：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，提供方式為凍干粉.

1.1.2 試劑

蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉、葡萄糖，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、次甲基藍(lán)(純度≥98%)、酚酞、無水乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)器股份有限公司；PL-203電子天平，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；WMK-08恒溫培養(yǎng)箱，DSX-280B蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠.

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

將兩種保藏的酵母凍干粉取少量加入含有2%葡萄糖的無菌水中，37 ℃恒溫水浴復(fù)水25 min；取2%的菌懸液接種至YPD培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h，稀釋涂布于YPDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，在YPDA固體培養(yǎng)基上選擇菌落特征明顯的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于150 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)24 h制成種子液.

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

將海紅果濃縮汁稀釋3.5倍得到的與海紅果鮮榨汁糖度相近的果汁，其可溶性固形物為20 °Brix，總酸為15.4 g/L，還原糖為159.46 g/L，pH 3.47.

1.3.3 兩種非釀酒酵母對酒精的耐受性考察

將1.3.1節(jié)中活化好的兩種非釀酒酵母種子液分別以2%的接種量接種于酒精體積分?jǐn)?shù)0、2%、4%、6%、8%、10%的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)34 h左右，用蒸餾水調(diào)零，測定不同酒精體積分?jǐn)?shù)下的非釀酒酵母的OD630值，并重復(fù)三次測定，依據(jù)不同酒精度下的OD630值考察非釀酒酵母的酒精耐受性.

1.3.4 兩種非釀酒酵母對SO2的耐受性考察

將1.3.1節(jié)中活化好的兩種非釀酒酵母種子液分別以2%的接種量接種于SO2質(zhì)量濃度分別為0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)34 h左右，用蒸餾水調(diào)零，測定不同SO2質(zhì)量濃度下的OD630值.重復(fù)三次檢測，依據(jù)不同SO2濃度下的OD630值考察非釀酒酵母的二氧化硫耐受性.

1.3.5 兩種非釀酒酵母對糖的耐受性考察

將1.3.1節(jié)中活化好的兩種非釀酒酵母種子液分別以2%的接種量接種于葡萄糖質(zhì)量濃度分別為0、50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)34 h左右，用蒸餾水調(diào)零.測定不同葡萄糖質(zhì)量濃度下的非釀酒酵母的OD630值，重復(fù)三次測量，依據(jù)不同糖度下的OD630值考察非釀酒酵母的糖的耐受性.

1.3.6 發(fā)酵性能參數(shù)測定

將兩種非釀酒酵母分別接種于海紅果汁中，23 ℃培養(yǎng)8天，每隔24 h測發(fā)酵過程中還原糖，酒精度，總酸，酵母數(shù)量并分析其變化情況.

1.3.7 分析方法

(1)理化指標(biāo)的測定[17]

還原糖測定采用斐林試劑法；總酸測定采用酸堿中和滴定法；酒精度的測定采用密度瓶法；pH值采用pH計法.

(2)酵母發(fā)酵性能

采用CO2失重法[18].每隔24 h稱重一次，計算凈質(zhì)量，直至發(fā)酵結(jié)束.

(3)酵母計數(shù)

采用血球計數(shù)板計數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種非釀酒酵母對酒精的耐受性

酒精度是低度果酒最重要的控制指標(biāo)，酵母的酒精耐受性越高，得到的果酒酒精度越高.發(fā)酵液的OD值與酵母濃度或數(shù)量成正比.因此，OD630可用于表征酵母對酒精耐受性，亦可表示非釀酒酵母對二氧化硫和糖的耐受性.

圖1是兩種非釀酒酵母在不同酒精度下的菌體生長曲線，結(jié)果表明當(dāng)酒精度≥4%vol時，檸檬形克勒克酵母的生長受到嚴(yán)重抑制，而東方伊薩酵母的生長影響偏小；當(dāng)酒精度≥8%vol時，東方伊薩酵母的生長受到嚴(yán)重抑制，而檸檬形克勒克酵母幾乎停止生長，逐漸走向衰亡期.

因此，東方伊薩酵母對酒精的耐受性為8%vol，而檸檬形克勒克酵母對酒精的耐受性為4%vol.基于上述分析，東方伊薩酵母適于酒精度為8%vol的果酒的釀造，而檸檬形克勒克酵母則適用于更低酒精度果酒的釀造.

圖1 酒精度對非釀酒酵母生長的影響

2.2 兩種非釀酒酵母對SO2的耐受性

果酒在發(fā)酵過程中，為防止雜菌污染發(fā)酵液中會加入SO2，雖然起到抗氧化和護(hù)色的作用，但是也會抑制酵母的生長，對發(fā)酵產(chǎn)生不良影響.圖2為不同二氧化硫濃度下的非釀酒酵母菌體生長曲線，發(fā)酵液OD630值越高表明相應(yīng)SO2濃度下，非釀酒酵母生長受到的擬制作用越小，結(jié)果表明當(dāng)SO2質(zhì)量濃度<100 mg/L時，兩種酵母的生長受到抑制較小.當(dāng)SO2質(zhì)量濃度≥100 mg/L時，檸檬形克勒克酵母的生長受到嚴(yán)重抑制，酵母生長量大幅度下降，東方伊薩酵母的生長也受到一定的抑制，酵母生長量在逐漸減少.因此，兩種非釀酒酵母發(fā)酵果酒時添加的SO2質(zhì)量濃度應(yīng)小于100 mg/L.

圖2 SO2對非釀酒酵母生長的影響

2.3 兩種非釀酒酵母對糖的耐受性

一般來說，水果中的糖含量為15 °Brix左右，采用留糖發(fā)酵生產(chǎn)低度酒，發(fā)酵結(jié)束后酒中糖含量在50 °Brix～100 °Brix，其口感好，廣受消費者的青睞，如果酵母對糖的耐受性好，可以在較大范圍調(diào)整發(fā)酵果汁中糖含量，可生產(chǎn)出不同糖度的低度果酒，滿足各種不同糖度要求的消費者，同時提高了的銷售的靈活性，因此，對兩種非釀酒酵母的糖耐受性進(jìn)行了考察.

市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，3%vol～8%vol的果酒廣受歡迎，因而果汁中糖度最高控制在25 °Brix，在此條件下可以發(fā)酵得到酒精度為8%vol，糖度為124 g/L的甜型酒，糖度再高，其爽口性差.因此，考察兩種非釀酒酵母糖耐受量最高值為250 g/L.

圖3給出了不同初始糖度下兩種非釀酒酵母的菌體生長曲線.從圖中可得知，在葡萄糖濃度為250 g/L范圍內(nèi)兩種非釀酒酵母都有較好的耐受性，說明兩種非釀酒酵母均可用于糖度廣泛的果酒釀造.

圖3 葡萄糖對非釀酒酵母生長的影響

2.4 發(fā)酵性能參數(shù)的測定

2.4.1 非釀酒酵母發(fā)酵性能的測定

酵母在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量二氧化碳，通過測定酵母發(fā)酵過程中二氧化碳的釋放量來評價酵母的發(fā)酵性能.圖4給出了發(fā)酵過程中二氧化碳釋放量與時間的對應(yīng)關(guān)系，反映了酵母菌發(fā)酵強度的變化.在發(fā)酵過程中，兩種非釀酒酵母產(chǎn)生氣泡較少，東方伊薩酵母與檸檬形克勒克酵母相比，東方伊薩酵母的發(fā)酵速率高于檸檬形克勒克酵母.檸檬形克勒克酵母在第4天后逐漸達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，可能是因為發(fā)酵后期逐漸進(jìn)入衰亡期；而東方伊薩酵母一直處于上升狀態(tài)，表明發(fā)酵強度大，發(fā)酵能力強.

圖4 非釀酒酵母發(fā)酵性能

2.4.2 發(fā)酵過程中還原糖含量和酒精度的變化

果酒的酒精發(fā)酵原理是果汁中含有的糖經(jīng)過酵母產(chǎn)生的一系列酶的作用，經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)變化，產(chǎn)生乙醇和二氧化碳.果汁中的葡萄糖和果糖直接被利用，而多糖經(jīng)過分解酶和轉(zhuǎn)化酶的作用生成單糖參與酒精發(fā)酵.

由圖5(a)可以看出，兩種酵母發(fā)酵海紅果酒的還原糖含量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸降低.東方伊薩酵母發(fā)酵的海紅果酒從第2天開始還原糖含量大幅度降低，在發(fā)酵結(jié)束后還原糖含量達(dá)到85.4 g/L.檸檬形克勒克酵母發(fā)酵的海紅果酒從第4天開始還原糖含量逐漸下降，發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到84.1 g/L.

由圖5(b)可知，東方伊薩酵母發(fā)酵的海紅果酒酒精度高于檸檬形克勒克酵母發(fā)酵的海紅果酒.從第5天開始兩種酵母發(fā)酵的海紅果酒酒精度開始大幅度提升，到第7天趨于平穩(wěn)狀態(tài).對比海紅果酒中的還原糖含量和酒精度變化趨勢，第7天海紅果酒中還原糖含量還在降低但酒精度已達(dá)到穩(wěn)定，由此推斷海紅果酒在發(fā)酵時產(chǎn)生酒精的同時可能產(chǎn)生一些其他物質(zhì).發(fā)酵結(jié)束后兩種非釀酒酵母果酒的糖度均在85 g/L左右，而酒精度分別為2.72%vol和2.44%vol，因此兩種非釀酒酵母均可作為低度果酒的發(fā)酵劑.

(a)還原糖含量的變化

2.4.3 發(fā)酵過程中總酸含量和pH的變化

酸是果酒的骨架，缺酸的果酒酒體不豐滿，立體感差，而酸度過高則對口感產(chǎn)生不良影響，pH是果酒質(zhì)量重要的控制指標(biāo)之一，一般來講pH3～3.5的酒不僅可有效防止雜菌污染，同時具有很好的穩(wěn)定性[19,20].

圖6分別給出了發(fā)酵過程中總滴定酸和pH的變化.由圖6(a)可知，非釀酒酵母發(fā)酵的海紅果酒前期酸度降低，說明非釀酒酵母分解酸的能力大于產(chǎn)酸的能力；在第2天和第4天開始檸檬形克勒克酵母和東方伊薩酵母發(fā)酵的海紅果酒總酸分別升高，則是因為該酵母在發(fā)酵時產(chǎn)生的二氧化碳較少，部分二氧化碳溶于發(fā)酵液中，產(chǎn)生乙酸等有機酸；在第3天和第6天后發(fā)酵液總酸分別開始下降，說明隨著發(fā)酵速率逐漸加快，酒精度上升導(dǎo)致酸度降低；在第6天和第7天后發(fā)酵曲線呈現(xiàn)上下波動，是因為非釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機酸的同時也在分解果酒中的有機酸.

由圖6(b)可知，非釀酒酵母發(fā)酵的海紅果酒發(fā)酵前期發(fā)酵液中葡萄糖被分解形成丙酮酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，進(jìn)而形成檸檬酸，異檸檬酸等有機酸[21]導(dǎo)致pH降低；第3天后發(fā)酵速率加快，酒精度升高，使酒中的有機酸降低，pH升高；第5天后發(fā)酵趨于穩(wěn)定導(dǎo)致pH逐漸趨于穩(wěn)定.

(a)總酸含量的變化

2.4.4 發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的變化

為了進(jìn)一步驗證兩種非釀酒酵母對酒精度的耐受性，對海紅果低度酒發(fā)酵曲線進(jìn)行了測定，其結(jié)果如圖7所示.

由圖7可知，海紅果酒的酵母數(shù)量隨著發(fā)酵時間的延長而增多.檸檬形克勒克酵母發(fā)酵的海紅果酒在第7天酵母數(shù)量達(dá)到最大值，酒精度為2.4%vol，而東方伊薩酵母發(fā)酵的海紅果酒在第6天酵母數(shù)量達(dá)到最大值，酒精度為2.28%vol.說明隨著海紅果酒酒精度的增長，兩種酵母均受到了抑制，從而使酵母數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢.但是由于東方伊薩酵母酒精耐受性高于檸檬形克勒克酵母，導(dǎo)致最終東方伊薩酵母發(fā)酵的海紅果酒產(chǎn)生的酒精度高于檸檬形克勒克酵母.

圖7 發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的變化

3 結(jié)論

通過對兩種非釀酒酵母耐受性及發(fā)酵特性的研究，得到以下結(jié)論：

東方伊薩酵母在不同酒精度和二氧化硫濃度下的耐受性高于檸檬形克勒克酵母；東方伊薩酵母發(fā)酵性能優(yōu)于檸檬形克勒克酵母；兩種非釀酒酵母均適于低度果酒的釀造，東方伊薩酵母發(fā)酵酒精度為2.72%vol，檸檬形克勒克酵母發(fā)酵酒精度為2.44%vol，基于對糖有很好的耐受性，二者均可釀造系列糖度的低度果酒.

綜上，兩種非釀酒酵母發(fā)酵海紅果酒時均可釀造出低酒精度的果酒，經(jīng)感官評價其中檸檬形克勒克酵母發(fā)酵的海紅果酒比東方伊薩酵母發(fā)酵的海紅果酒的果香味更濃郁.后期研究可分析檢測酒中的香味物質(zhì)，以此來分析非釀酒酵母提高海紅果酒果香味的原因.