方翔永

（河北大學生命科學學院，河北 保定）

0 引言

在有性生殖的過程中，精子和卵子結合成受精卵，并攜帶了雙親的遺傳信息，保證了遺傳的穩(wěn)定性。在形成受精卵之前，精子會發(fā)生頂體反應。頂體反應（Acrosome reaction, AR）是受精前的重要步驟，并與精子獲能、精卵識別與融合等[1]過程相關。目前，精子發(fā)生頂體反應涉及到各種精子膜蛋白，如hSMP 為人類重要的精子膜蛋白，Cheng 等[2]運用hSMP 抗體作用于小鼠精子，發(fā)現(xiàn)該抗體可以抑制小鼠的頂體反應和精卵結合過程。并且頂體反應涉及到了多條信號通路，如泛素-蛋白酶體途徑[3]、磷酸肌醇依賴性途徑[4]等途徑。此外，有研究表明精子發(fā)生頂體反應還依賴于Ca2+濃度，并涉及到多條互補的信號通路[5]。

莠去津（Atrazine）最初是作為一種除草劑，目前也公認該物質(zhì)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可對不同物種產(chǎn)生毒性作用，并且其毒性作用體現(xiàn)在不同方面。Aurore 等[6]發(fā)現(xiàn)莠去津能干擾雄性小鼠的精子減數(shù)分裂過程，Huang 等[7]研究表明莠去津可以破壞DNA 雙鏈的形成。本實驗室在前期主要以中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）為材料，通過研究中華絨螯蟹精子，揭示出莠去津?qū)又械娜樗崦摎涿负退嵝粤姿崦妇尸F(xiàn)倒“U”形毒性效應，即莠去津在中間濃度時毒性最強[8]。

網(wǎng)絡毒理學是基于網(wǎng)絡藥理學發(fā)展起來的一項生物信息學技術，通過檢索毒性物質(zhì)作用靶點和所要作用的組織靶點，并取交集可得到毒性物質(zhì)作用于特定組織的靶點信息。目前，常用的網(wǎng)絡毒理學數(shù)據(jù)庫為TOXNET（https://toxnet.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫[9,10]，該數(shù)據(jù)庫包括了一系列子數(shù)據(jù)庫，如TOXLINE、CTD、IRIS 等，是目前最全面的網(wǎng)絡毒理學數(shù)據(jù)庫。

本研究通過網(wǎng)絡毒理學的方法，用以揭示出莠去津?qū)τ谌祟惥禹旙w反應的毒性作用，探討其作用靶點，并有利于今后通過實驗證明莠去津抑制這些靶點，來探討莠去津?qū)禹旙w反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

從北京維通利華實驗動物技術有限公司采購40 只性成熟雄性BALB/c 小鼠，體重約為(30±7)g，并常規(guī)適應性飼養(yǎng)7 天。

1.1.2 試劑

莠去津，由百靈威科技有限公司提供；M2 受精培養(yǎng)基，由Sigma 公司提供；精子活力試劑盒，由abcam 公司提供；石蠟油，異丙醇，75%乙醇，0.1M PBS 緩沖液，均由上海吉至生化科技有限公司提供；TRIzol 試劑，DEPC 水，Oligo（dT）(10mM)，Reaction Buffer，dNTP Mix，RibolockTM Rnase inhibitor，RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase,RNase Free water，以上試劑均由ThermoFisherScientific 公司；莠去津各作用靶點的上下游PCR 引物，均由上海伯豪生物技術有限公司合成。

1.1.3 設備

高速冷凍離心機，由Sigma 公司提供;PCR 儀，由Applied Biosystems 公司提供；Step One TM Software v 2.1 擴增儀，由北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司提供；倒置顯微鏡，由Olympus 公司提供。

1.1.4 數(shù)據(jù)庫及軟件

TOXNET（https://toxnet.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫、CTD 數(shù) 據(jù)庫（http://ctdbase.org/）、Genecards（https://genecards.weizmann.ac.il/）數(shù)據(jù)庫、Cytoscape3.2.1、Cytoscape3.2.1 中的ClueGo 插件。

1.2 方法

1.2.1 查詢和篩選莠去津作用靶點

登錄TOXNET 數(shù)據(jù)庫，選擇CTD 子數(shù)據(jù)庫，因TOXNET數(shù)據(jù)庫中的靶點信息不全，故需通過TOXNET 數(shù)據(jù)庫進入CTD 數(shù)據(jù)庫主頁，選擇“Gene-interaction”子選項，運用高級查詢功能，在“Chemical”項中輸入“Atrazine”，在“Organism”項中輸入“Homo sapiens”，去除重復靶點信息，得到莠去津作用于人類的靶點信息。

1.2.2 查詢?nèi)祟惥禹旙w反應相關靶點

運用Genecards 數(shù)據(jù)庫，在搜索框中輸入關鍵詞“Sperm+Acrosome reaction”，得到與人類精子頂體反應相關的靶點信息。運用Cytoscape3.2.1 軟件中的ClueGo 插件分析收集到的人類精子頂體反應相關靶點的GO 生物學過程和KEGG 代謝通路。

1.2.3 整合靶點信息

將上述收集到的莠去津作用于人類的靶點信息與人類精子頂體反應相關的靶點信息取交集，得到莠去津作用于人類精子頂體反應的靶點信息，并整理成Excle 表格。

1.2.4 靶點通路分析

運用Cytoscape3.2.1 軟件中的ClueGo 插件對整合得到的靶點信息進行GO 生物學過程和KEGG 代謝通路分析，得到這些整合的靶點信息所涉及的生物學過程。

1.2.5 動物實驗

經(jīng)7 天適應性飼養(yǎng)后，隨機將小鼠分為空白組、低劑量莠去津組、中劑量莠去津組和高劑量莠去津組，每組各10 只，其中空白對照組灌胃蒸餾水0.3mL/只，低劑量莠去津組、中劑量莠去津組和高劑量莠去津組分別按照莠去津100mg/kg、200mg/kg 和300mg/kg 的標準配置莠去津溶液，并分別灌胃各莠去津溶液0.3mL，以上各組均處理15 天。

1.2.6 檢測精子頂體反應率[11]

15 天處理完后處死小鼠，并取小鼠附睪末端在37℃下置于0.1M PBS 緩沖液中30min，隨后將附睪置于M2 受精培養(yǎng)基中，配制濃度為5×106精子/mL，于37℃條件下處理2h，并滴加石蠟油，使用精子活力試劑盒，根據(jù)說明書進行操作，檢測精子活性來反應精子頂體反應率。

1.2.7 實時定量PCR 方法檢測莠去津作用靶點的mRNA 表達情況

將收集到的小鼠附睪置于液氮中保存，加入1mL TRIzol，離心10min；取 上清，加入 0.2mL 氯仿, 離心15min；取 上清,加入 0.5mL 異丙醇，離心10min；去上清，在沉淀中加入1mL 75 ℅乙醇（DEPC 水配制）,離心5min，去上清，室溫干燥；加入20-50 μL DEPC 水, 促溶，-80℃保存?zhèn)溆茫灰陨细鞑侩x心條件皆為4℃，12000rpm。在保存的樣品中加入總 RNA（質(zhì)量為1ug）、10μM Oligo（dT）1μL，加入DEPC水至12μL，混勻；置于PCR 儀上 65℃，5min，冷卻后加入5×Reaction Buffer 4.0μL、10mM dNTP Mix 2uL、 RibolockTM Rnase inhibitor1μL、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase1μL；依 次 置 于PCR 儀 上42 ℃，60min、70 ℃，5min，得到cDNA,-80℃保存。取出cDNA，稀釋10 倍，由上下游引物各1uL，cDNA1uL，RNase Free water 2uL 構成反應體系，其反應條件依次為95℃，5min、95℃，2s、60℃，10s，循環(huán)40 次，按2-ΔΔCt公式計算。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPadPrism8.0.1 軟件繪制莠去津?qū)禹旙w反應率影響數(shù)據(jù)的柱狀圖，若P＜0.05 則具有統(tǒng)計學意義；采用SPASS 23.0 統(tǒng)計軟件分析實時定量PCR 結果，該結果為計量資料，以±s 表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，若P＜0.05 則具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 通過查詢CTD 數(shù)據(jù)庫，并合并重復靶點，得到的莠去津作用于人類的靶點信息共有3010 個。

2.2 通過查詢Genecards 數(shù)據(jù)庫得到與人類精子頂體反應相關的靶點共有34 個，分析GO 生物學過程和KEGG 代謝通路，可知這些靶點除了與頂體反應相關外，還涉到精子獲能、精卵識別與融合等過程。結果見表1，通路信息見圖1。

2.3 將兩個數(shù)據(jù)庫所收集到的靶點信息取交集，可以得到莠去津作用于人類精子頂體反應的靶點為4 個（DLD、PLCD4、SYT8、TRIM36），這些靶點可為莠去津?qū)θ祟惥禹旙w反應毒性作用的關鍵。其中莠去津作用于DLD、PLCD4 和TRIM36 為抑制作用，SYT8 為促進作用。收集到的靶點信息見表2。

2.4 在莠去津處理期間，各組小鼠均能正常飲食飲水，未出現(xiàn)小鼠死亡的現(xiàn)象。

2.5 與空白對照組相比，其他三組的精子頂體反應率明顯低于空白對照組，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；低、中、高劑量莠去津組相互比較發(fā)現(xiàn)，中劑量莠去津組精子頂體反應率最低，且與另外兩組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，符合相關文獻提到的莠去津倒“U”形毒性效應。其結果見圖2。

2.6 DLD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 的上下游引物序列均由上海伯豪生物技術有限公司合成，其結果如 下：DLD 上游為GAGCTGGAGTCGTGTGTACC，下游為 GAACCTATCACTGTCACGTCAG；PLCD4上游為 ATTCAAGACCTACTAGCCACTGA，下游為 CTCCACCAGATAGCGCAACAA；SYT8 上游為GGCCCAGTCTCATCCCAG A， 下游為GATGGCGATAAAGAGGGTCCA；TRIM 36 上游為 CGTTCAATGATGTGGCGTCAG， 下游為GGGTCAGTGAATTACGCTTCC。與空白對照組相比，其他三組的DLD、PLCD4、TRIM36 的mRNA 表達量明顯降低，SYT8 的mRNA 表達量明顯升高，且均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；低、中、高劑量莠去津組相互比較發(fā)現(xiàn)，中劑量莠去津組DLD、PLCD4 和TRIM36 的mRNA 表達量最低，SYT8 的mRNA 表達量最高，且與另外兩組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，符合倒“U”形毒性效應。其結果見表3。

圖1 人類精子頂體反應相關靶點GO 生物學過程和KEGG 代謝通路

表1 人類精子頂體反應相關靶點信息

續(xù)表1

表2 莠去津作用于人類精子頂體反應靶點信息

表3 莠去津?qū)π∈驞LD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 的mRNA 表達量的影響

圖2 莠去津?qū)π∈缶禹旙w反應率的影響

3 討論

生物的有性生殖過程涉及到精卵識別與結合的過程，在發(fā)生該過程前，精子需要發(fā)生頂體反應，以期獲得足夠的能量。在發(fā)生頂體反應前，精子需要通過獲能的步驟達到頂體反應發(fā)生的必要條件，但主要發(fā)生在哺乳動物中，近期有研究認為非哺乳動物發(fā)生頂體反應無需精子獲能[12]。本課題組主要研究的實驗材料為中華絨螯蟹，不屬于哺乳類動物，可推測精子獲能不是中華絨螯蟹發(fā)生頂體反應的必要條件，在今后研究中華絨螯蟹頂體反應時不受精子是否獲能影響。目前關于莠去津影響精子頂體反應的研究缺乏，本研究主要通過網(wǎng)絡毒理學來發(fā)現(xiàn)莠去津如何影響頂體反應進程，并發(fā)現(xiàn)其作用靶點，并通過動物實驗進行驗證。

通過網(wǎng)絡毒理學方法發(fā)現(xiàn)莠去津作用于精子頂體反應為以下4 個靶點：二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide Dehydrogenase,DLD)、 磷 脂 酶Cδ4(Phospholipase C Delta 4,PLCD4)、突觸受體8(Synaptotagmin 8,SYT8) 和三方基序包含蛋白36(Tripartite Motif Containing 36,TRIM36)，其中莠去津能抑制DLD、PLCD4 和TRIM36 基因表達，促進SYT8 基因表達。通路分析結果顯示，這些靶點涉及的通路為頂體反應，表明這些靶點主要作用于頂體反應本身，對于精子獲能、精卵識別等相關過程影響較小。

DLD 是形成丙酮酸脫氫酶體系的一種前體物質(zhì)，可參與三羧酸循環(huán)過程。Sharmila 等[13]研究表明DLD 可與二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase,E2)的結合域作用，可為E2 的脂酰結構域可移動到該復合物中，形成重要的多酶體系。目前，有些研究報道稱DLD 表達缺失可導致血漿瓜氨酸升高[14]、急性肝衰竭復發(fā)[15]等表現(xiàn)，說明DLD 靶點與多種病理過程相關。目前文獻中關于DLD 與頂體反應的關系報道較少，Vivek 等[16]以倉鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)DLD、活性氧（ROS）、cAMP 和Ca2+在倉鼠精子的頂體反應必不可少，抑制DLD 可減少活性氧產(chǎn)生和cAMP 水平，并進一步導致頂體反應功能減退。

PLCD4 可參與細胞周期的調(diào)節(jié)作用。該物質(zhì)由Liu[17]首次報道，為誘導細胞周期進入S 期的新物質(zhì)，其定位與細胞核上。Marianna 等[18]以人間充質(zhì)干細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)將PLCD4 基因敲除可增加G1 期細胞和減少間期及G2/M 期細胞比例，并且PLCD4 基因未敲除的干細胞其衰老細胞比例較高，表明該靶點可促進間充質(zhì)干細胞增殖與衰老過程。PLCD4 在精子頂體反應發(fā)生過程中，也是一種不可或缺的成分。Fukami 等[19]研究了多種磷脂酶C 亞型在哺乳動物生殖細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)PLCD4 在表達上處于優(yōu)先地位，在透明帶誘導的頂體反應中必不可少。

SYT8 為莠去津作用的4 個靶點中唯一一個促進其表達的靶點，屬于膜轉(zhuǎn)運蛋白大家族，在神經(jīng)細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和內(nèi)分泌細胞中均有表達，但靶點不作為Ca2+傳感器，具有無Ca2+ 敏感的可溶性[20]。SYT8 作為一種突觸受體，可參與SNARE 蛋白介導的膜泡運輸過程和胞吐作用。SNARE蛋白即可溶性的N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein attachment protein receptor)為一大類膜蛋白家族，主要通過形成SNARE 蛋白復合體，在膜融合和物質(zhì)運輸中有重要作用。在人類精子頂體反應中，SNARE 蛋白起著不可或缺的作用[21]。通過以上研究可推測莠去津作用于SYT8 靶點可間接通過SNARE 蛋白影響精子的頂體反應過程。

TRIM36 為三方基序包含蛋白成員之一，該類蛋白家族與腫瘤關系較密切，目前已有多篇關于兩者關系的報道，如TRIM25 可促進結直腸癌進展[22]、TRIM29 與胃癌的關系[23]等。Man 等[24]報道稱TRIM36 基因高表達能夠提高胃癌放療患者的總體生存率，表明該靶點為放療治療胃癌的重要靶點，可能為胃癌放療敏感性的潛在靶點。目前研究TRIM36 與精子頂體反應的關系無專門的文獻報告，僅有Hering 等[25]通過全基因組關聯(lián)分析研究公牛的精子運動過程，發(fā)現(xiàn)TRIM36與精子運動有關，故研究TRIM36 與精子頂體反應的關系具有較大意義。

綜上所述，運用網(wǎng)絡毒理學的方法發(fā)現(xiàn)莠去津可通過DLD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 這4 個靶點對精子頂體反應過程產(chǎn)生影響，其中莠去津?qū)LD、PLCD4 和TRIM36 起抑制作用，對SYT8 起促進作用。通過GO 生物學過程和KEGG代謝通路分析，可以發(fā)現(xiàn)上述靶點作用的生物學過程為頂體反應，進一步驗證了網(wǎng)絡毒理學方法具有一定的可靠性。通過動物實驗也表明，莠去津可降低頂體反應率，對精子的頂體反應有抑制作用，并且可使DLD、PLCD4 和TRIM36 的mRNA 表達量降低，SYT8 的mRNA 表達量升高，且中劑量莠去津組尤為明顯，符合文獻中所提高的倒“U”形毒性效應。本研究僅以人類精子頂體反應過程的相關信息，并輔以小鼠的動物實驗加以驗證，對于中華絨螯蟹等非哺乳類動物是否準確有待進一步實驗研究。